微生物生物膜定植力检测：原理、方法与意义
微生物生物膜是微生物在自然或人工表面附着后，通过自身产生的胞外聚合物（EPS）包裹形成的结构化群落。这种生存方式赋予微生物远超其浮游状态的环境适应性和抗性，成为感染、工业污染、设备腐蚀等诸多领域的关键问题。因此，准确评估微生物形成生物膜的定植力（即附着、聚集、形成稳定生物膜的能力）至关重要。本文将系统阐述生物膜定植力检测的原理、常用方法及其应用价值。
一、 生物膜定植力检测的核心意义
- 评估致病风险： 在医疗领域（如植入物感染、慢性伤口感染）和食品工业中，检测病原微生物的生物膜形成能力，是预测其潜在致病性和传播风险的关键指标。定植力强的菌株更具危害性。
- 监控污染控制效果： 在工业水系统、食品加工线、冷却塔等场景，生物膜是顽固污染源和腐蚀源。检测相关微生物的定植力，有助于评估清洁消毒程序的效能，优化控制策略。
- 筛选抗菌/抗生物膜材料/制剂： 研发新型抗菌涂层、抗生物膜药物或消毒剂时，需可靠的方法评价其对微生物定植过程的抑制作用。
- 环境微生物生态研究： 理解特定环境中微生物群落的定植行为及其与环境因素的相互作用。
- 菌株特性鉴定： 生物膜形成能力是某些微生物的重要表型特征，可用于菌株分型或鉴定。
二、 生物膜定植力检测的核心原理
检测的核心在于模拟微生物在目标表面的定植过程，并量化其形成的生物膜量或生物活性。检测通常包括以下基本步骤：
- 表面准备： 提供待测的固体表面（如塑料、金属、玻璃、或模拟组织/材料的涂层）。
- 微生物接种： 将目标微生物（单一菌种或混合群落）以一定浓度接种到含有培养液的检测系统中。
- 定植培养： 在适宜条件下（温度、时间、营养、静置或流动状态）进行培养，允许微生物附着、增殖并形成生物膜。
- 去除浮游菌： 轻柔移除培养液并洗涤表面，去除未附着的浮游细胞。
- 生物膜染色/裂解： 对附着在表面的生物膜进行染色（可视化、量化生物量）或裂解（释放细胞内含物）。
- 定量分析： 通过测量染色强度、代谢活性或特定分子含量来量化生物膜。
三、 常用生物膜定植力检测方法
根据检测目标和定量方式，主要分为以下几类：
-
生物量染色定量法 (最常用)：
- 原理： 使用染料特异性结合生物膜组分（如蛋白质、多糖、核酸、细胞膜），通过比色或荧光强度反映生物膜总量。
- 代表方法：
- 结晶紫 (Crystal Violet, CV) 染色法： 最经典、经济的方法。CV 结合生物膜内的阴离子组分（如胞外多糖、核酸、酸性氨基酸）。染色后溶解染料，测量溶液在特定波长（如 570nm 或 595nm）的光密度 (OD) 值，与生物膜生物量正相关。优点：操作简单、成本低、高通量（适用于微孔板）。缺点：不能区分死活细胞，可能被残留培养基干扰，对薄生物膜不敏感。
- SYTO 系列核酸染料法： 使用可穿透细胞膜的核酸荧光染料（如 SYTO® 9）。裂解生物膜后测量荧光强度，反映总细胞数量（包含死活细胞）。优点：灵敏度较高。缺点：成本高于 CV，需要荧光检测设备。
- 其他染料： 刚果红（结合胞外多糖）、荧光增白剂（如 Calcofluor White，结合几丁质/纤维素）等，应用相对较少。
-
代谢活性检测法：
- 原理： 检测生物膜内活细胞的代谢活性，间接反映生物膜的活力和定植强度。
- 代表方法：
- 四唑盐还原法 (如 XTT, MTT, resazurin)： 活细胞代谢过程中产生的还原酶可将无色的四唑盐/刃天青还原成有色的甲臜或高荧光的试卤灵。测量显色或荧光强度可反映活细胞数量/代谢活性。优点：反映生物膜活力，对评估抗菌剂效果尤为重要。缺点：结果受代谢状态影响，试剂成本较高，某些菌种还原能力弱。
- ATP 生物发光法： 裂解生物膜细胞，利用荧光素酶-荧光素系统检测 ATP 含量。ATP 是活细胞的能量货币，其含量与活细胞数量正相关。优点：灵敏度极高，快速。缺点：仪器昂贵，操作需严谨，易受干扰。
-
基于分子生物学的方法：
- 原理： 检测生物膜内特定微生物的核酸（DNA/RNA）含量。
- 代表方法：
- 定量聚合酶链式反应 (qPCR)： 针对目标微生物的特异性基因（如 16S rRNA 基因）进行定量扩增，精确测定生物膜内特定微生物的绝对数量。优点：特异性高，可区分菌种/菌株，灵敏度极高。缺点：成本高，操作复杂，需要专业设备和技术，不能区分死活细胞（除非结合活菌染料或测 RNA）。
- 其他： 荧光原位杂交 (FISH) 等，多用于结构观察和特定菌定位，定量应用较少。
-
显微镜观察法：
- 原理： 直接观察生物膜在表面的附着形态、覆盖度、厚度和结构。
- 代表方法：
- 光学显微镜 (带染色)： 如革兰氏染色、荧光染色（如 SYTO 9/PI 区分死活）后观察生物膜形态和细胞分布。简单直观，但定量困难。
- 共聚焦激光扫描显微镜 (Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM)： 最强大的可视化工具。可对活生物膜进行非侵入性、断层扫描（Z-stack），获取三维结构信息（厚度、生物量、空隙率、胞外多糖分布），结合荧光染色可区分不同菌种或不同生理状态的细胞。优点：提供最丰富的结构和空间信息。缺点：设备昂贵，操作复杂，通量低，难以精确定量整个表面。
- 扫描电子显微镜 (SEM)： 提供生物膜表面形貌的超高分辨率图像。缺点：样品制备复杂（需固定、脱水、镀膜），无法观察活体状态，可能引入假象，定量困难。
四、 方法选择与标准化挑战
- 选择依据： 没有“万能”方法。选择需考虑：
- 检测目标： 是总生物量、活细胞量、特定菌种还是结构？
- 样本类型： 是标准模型表面（如聚苯乙烯板）还是复杂表面（如导管、组织工程材料）？
- 通量要求： 需要高通量筛选还是精细分析？
- 设备与成本： 实验室现有条件及预算。
- 数据需求： 需要简单定量还是复杂结构信息？
- 标准化挑战： 生物膜检测结果的可比性是关键挑战。不同实验室间结果差异常源于：
- 培养条件（培养基成分、温度、时间、流体状态 - 静态 vs 动态流动腔）
- 接种物状态（菌龄、浓度、悬浮介质）
- 洗涤步骤（力度、次数、缓冲液）
- 染色/裂解程序（试剂浓度、时间）
- 定量方法（仪器校准、计算公式）
- 表面特性（材质、粗糙度、亲水性）
- 努力方向：建立和遵循国际/行业认可的标准化操作规程 (SOPs) 至关重要。
五、 结论
微生物生物膜定植力检测是理解微生物在表面生存行为、评估相关风险、开发控制策略和评价干预手段的核心技术。从经典的结晶紫染色到高端的共聚焦显微镜成像，多种方法各具优势与局限。研究者需根据具体需求和条件选择合适的方法，并充分认识到标准化操作对于获得可靠、可比结果的重要性。随着技术进步和标准化工作的推进，生物膜定植力检测将在医疗健康、食品安全、工业生产及环境科学等领域发挥越来越精准和重要的作用，为有效应对生物膜相关挑战提供科学依据。
（注：本文严格避免提及任何具体企业或品牌名称，所有技术方法均使用通用学术名称描述。）