光密度法检测活菌数：原理、操作与注意事项
光密度法（Optical Density, OD）是微生物实验中快速、简便地估算培养液中总菌体浓度（包含活菌与死菌）的常用方法。虽然它并非直接计数活菌，但在特定条件下（如指数生长期），其数值与活菌浓度（CFU/mL）存在高度相关性，常作为间接估算活菌密度的有效手段。
一、核心原理
该方法基于 Lambert-Beer 定律：
- 光束穿过微生物悬液时，微生物细胞会吸收和散射光线。
- 悬浮液中微生物浓度越高，透射光强度越弱，光密度值越高。
- 在特定波长（通常为 600 nm, 即 OD600）下，光密度值（OD）与悬液中微生物的浓度在一定范围内呈线性正相关。
关键点：OD 值反映的是培养液中所有颗粒（主要是菌体细胞）造成的浊度/遮光度，不能直接区分活菌与死菌。
二、实验所需仪器与材料示例
- 分光光度计： 能发射和检测特定波长光线（常用 600 nm）的仪器。
- 比色皿： 用于盛放待测菌悬液的透明容器（石英或光学玻璃）。
- 空白对照液： 用于校零的液体，必须与培养菌体的培养基成分一致（如新鲜无菌培养基或用于悬浮细胞的生理盐水/缓冲液）。
- 待测菌悬液： 需要检测的微生物培养物或稀释液。需保证均匀悬浮，无肉眼可见大颗粒或气泡。
- 振荡器或涡旋仪： 用于充分混匀菌悬液。
- 移液器与无菌吸头： 用于精确移取液体。
- 计时器： 确保读取 OD 值的时间点准确。
三、标准操作流程
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仪器预热与准备：
- 打开分光光度计，预热至稳定（通常 15-30 分钟）。
- 将波长设置为 600 nm。
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制备空白对照：
- 将空白对照液（如无菌培养基）小心倒入干净的比色皿中，液面高度约为比色皿高度的 3/4。
- 用无绒纸巾擦拭干净比色皿外表面的液体和指纹。
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仪器校零：
- 将装有空白对照液的比色皿放入样品室。
- 关闭样品室盖。
- 按下仪器的“Zero”或“Blank”键进行校零。此时仪器认为空白对照液的 OD600 = 0.000。
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样品准备与测量：
- 将待测菌悬液充分振荡或涡旋混匀（至关重要）。
- 取适量混匀的菌悬液，小心倒入另一个干净的比色皿中（液面高度与空白对照一致）。
- 仔细擦拭干净比色皿外表面。
- 将样品比色皿放入样品室。
- 关闭盖子，读取并记录稳定显示的 OD600 值。
- 若样品 OD 值过高（通常 > 1.0），超出线性范围，需用空白对照液进行适当稀释（如 1：10 稀释），混匀后重新测量，最终 OD 值需乘以稀释倍数（如稀释 10 倍，测得 OD=0.25，则实际 OD = 2.5）。
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清洁：
- 测量完毕后，立即倒出比色皿中的液体，用蒸馏水或去离子水彻底冲洗数次。
- 倒置晾干或使用压缩空气吹干，避免残留污染后续样品。
四、估算活菌数（CFU/mL）
光密度法不能直接给出活菌数。需要建立 OD600 与活菌浓度（CFU/mL）的标准曲线进行转换：
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绘制标准曲线：
- 将处于指数生长期的培养物进行一系列精确稀释（如 10⁻¹, 10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵, 10⁻⁶）。
- 对每个稀释度同时进行：
- OD600 测量： 按上述操作流程测量 OD 值。
- 平板菌落计数： 选取合适稀释度的菌液（通常 2-3 个能长出 30-300 个菌落的稀释度），涂布或倾注平板，培养后计数菌落形成单位（CFU）。
- 计算每个稀释度对应的平均 CFU/mL。
- 以 OD600 值为横坐标（X 轴），对应的 CFU/mL 值（取对数 log₁₀）为纵坐标（Y 轴），绘制散点图。
- 对指数生长期的数据点进行线性回归分析，得到线性方程：log₁₀ (CFU/mL) = a * OD600 + b（其中 a 为斜率，b 为截距）以及相关系数 R²（越接近 1 表明线性关系越好）。
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利用标准曲线估算未知样品：
- 测量待测样品的 OD600 值。
- 将此 OD600 值代入上述标准曲线的线性方程中。
- 计算得到的 Y 值是 log₁₀ (CFU/mL)。
- 对 Y 值取反对数（10^Y），即可估算出样品中的活菌浓度（CFU/mL）。
五、关键注意事项与局限性
- 区分总菌与活菌： OD 值反映的是总菌体浓度（包括活菌和死菌）。在细胞死亡但未裂解的情况下，死菌同样贡献浊度。因此，该方法仅适用于处于旺盛指数生长期的纯培养物，此时死菌比例低，OD 与活菌数相关性高。在稳定期和衰亡期，相关性会显著下降。
- 线性范围： Lambert-Beer 定律仅在一定的 OD 值范围内（通常 OD600 < 0.8，最优范围为 0.1-0.5）成立线性关系。超出此范围需稀释。
- 气泡与颗粒干扰： 比色皿内的气泡、菌悬液中的大颗粒杂质或沉淀物会强烈散射光，导致 OD 值异常升高。测量前必须充分混匀样品并避免产生气泡。
- 比色皿洁净度与匹配性： 比色皿必须彻底清洁且无划痕。不同比色皿之间可能有细微差异，最好固定使用同一个比色皿测量样品，或使用匹配的比色皿。
- 菌种特异性： 不同种类微生物的大小、形状、密度、聚集状态差异很大。每种菌株都需要建立自己专用的标准曲线，不可混用其他菌株或文献曲线（只能作为参考）。
- 培养基与背景干扰： 培养基成分（如染料、不溶性颗粒）本身可能有吸光度或浊度。必须使用相同的培养基或悬浮液作为空白对照。更换培养基后需要重新评估背景值或建立新曲线。
- 细胞聚集状态： 微生物发生聚集（成团、成链）时，OD 值与单个分散细胞悬液的 OD 值不同，可能导致估算偏差。需优化培养条件或采用物理方法（如超声、涡旋）分散聚集的细胞。
- 仪器差异： 不同型号的分光光度计的光路设计、检测器灵敏度可能存在差异。即使波长相同，测得 OD 值也可能略有不同。标准曲线应在同一台仪器上建立和使用。
六、总结
光密度法（OD600）是微生物实验室中快速、无损监测培养液总菌体密度变化的强大工具。通过建立可靠的标准曲线，它能够在微生物的指数生长期有效地间接估算活菌浓度（CFU/mL）。然而，使用者必须深刻理解其原理和局限性：它测量的是浊度而非活菌本身，其结果受到菌种特性、生长阶段、样品状态、测量条件等多方面因素的影响。严格遵守操作规程，充分注意干扰因素，并针对特定研究对象建立标准曲线，是获得准确可靠数据的关键。
该技术广泛应用于微生物生长动力学研究、发酵过程监控、接种量标准化、抗菌药物敏感性初步筛选等众多领域，是微生物学基础研究和应用研究中不可或缺的基础方法。