抗菌纺织品抑菌圈测试

抗菌纺织品抑菌圈测试技术详解

一、引言

随着消费者健康意识增强，具有抗菌功能的纺织品需求日益增长。抑菌圈测试（Agar Diffusion Test）作为评价纺织品抗菌性能的重要方法，因其操作简便、结果直观，在科研、质检及产品开发中广泛应用。该测试主要针对溶出型抗菌剂，通过测量抗菌剂在琼脂培养基上扩散形成的抑菌区域大小，评估其抑制微生物生长的能力。

二、测试原理

抑菌圈测试基于抗菌剂在固体培养基中的扩散作用：

1. 样品制备：将抗菌纺织品制成圆形或特定形状的试样。
2. 接种：在无菌培养皿中倒入熔化的营养琼脂培养基，冷却凝固后，均匀涂布或倾注一定浓度的特定微生物（如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等）菌悬液。
3. 贴样：将试样紧密贴附于已接种微生物的琼脂平板表面。
4. 扩散与培养：将平板置于适宜温度（通常37°C）培养18-24小时。期间，纺织品中的可溶性抗菌成分向周围琼脂中扩散。
5. 抑菌圈形成：在抗菌剂有效扩散范围内，微生物生长被抑制，形成透明的抑菌圈；抗菌剂无效区域则形成菌苔。
6. 结果测量：测量抑菌圈直径（或半径），包含样品直径。

三、核心测试要素

1. 测试菌种：

   • 常用代表性菌种：革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ATCC 6538）、革兰氏阴性菌（如大肠杆菌 Escherichia coli ATCC 25922）、真菌（如白色念珠菌 Candida albicans ATCC 10231）。选择依据产品宣称用途及标准要求。
   • 菌种需活化并制备成特定浓度的新鲜菌悬液（通常10^5 - 10^6 CFU/mL）。

2. 培养基：

   • 基础培养基：营养琼脂（Nutrient Agar, NA）、胰蛋白胨大豆琼脂（Tryptic Soy Agar, TSA）等，满足测试菌生长需求。
   • 培养基厚度需均匀一致（通常约4mm），影响抗菌剂扩散效果。

3. 样品要求：

   • 形状尺寸：标准圆形样片（如直径5mm）或规定形状样片。
   • 预处理：根据产品使用说明进行洗涤（如需），确保测试状态符合实际。
   • 无菌处理：样品表面需灭菌（如紫外线照射、环氧乙烷灭菌），避免杂菌干扰。

4. 对照设置：

   • 阴性对照：使用同材质但无抗菌处理的纺织品（或空白纸片），应无抑菌圈形成。
   • 阳性对照：使用已知有效抗菌剂（如特定浓度的抗生素片或标准抗菌样品），验证试验系统有效性。

5. 培养条件：

   • 温度：根据菌种选择（细菌通常37±1°C，真菌25-28°C）。
   • 时间：通常18-24小时（细菌），真菌可能需要更长时间（如48小时）。
   • 湿度：保持高湿度防止培养基干裂。

四、操作流程（示例）

1. 准备培养基：熔化营养琼脂，冷却至约45°C，倒入无菌平皿（约20mL/90mm平皿），凝固。
2. 制备菌悬液：挑取新鲜培养物至无菌生理盐水或缓冲液，调整至0.5麦氏浊度（约1-2×10^8 CFU/mL），再稀释至工作浓度（如10^6 CFU/mL）。
3. 接种平板：
   • 涂布法：取100μL工作浓度菌悬液均匀涂布于琼脂表面。
   • 倾注法：取1mL工作浓度菌悬液与15mL冷却至约45°C的熔融琼脂混合，迅速倾注于平皿中凝固。
4. 贴附样品：用无菌镊子将试样（及对照样）轻压贴于已接种琼脂表面，确保紧密接触。
5. 培养：将平皿正置，放入恒温培养箱培养规定时间。
6. 观察测量：培养后取出平皿，测量抑菌圈直径（含样品直径）。可用游标卡尺或专用测量仪，精确到0.1mm。记录各样品及对照结果。
7. 结果计算：
   • 抑菌圈宽度 = （抑菌圈总直径 - 样品直径）/ 2
   • 通常直接比较抑菌圈直径大小。

五、结果解读与报告

1. 有效性判定：

   • 阴性对照应无抑菌圈或仅有样品轮廓印痕。
   • 阳性对照应产生清晰、符合预期的抑菌圈。
   • 测试样品抑菌圈直径明显大于阴性对照时（通常差值≥1mm或依据标准规定），可认为具有抗菌效果。抑菌圈越大，表明抗菌剂溶出性和扩散性越强，抑制能力越显著。

2. 报告内容：

   • 测试依据标准（如ISO 20645, AATCC 147等）。
   • 测试菌种名称及编号。
   • 培养基名称。
   • 样品描述及预处理方式。
   • 培养温度和时间。
   • 各平行样及对照样的抑菌圈直径（mm）测量值。
   • 结果照片（清晰显示抑菌圈）。
   • 结论：是否具有抗菌效果（基于标准或约定阈值）。

六、方法优势与局限性

• 优势：
  • 操作相对简单，成本较低。
  • 结果直观可视，能定性甚至半定量（通过直径大小）评估溶出型抗菌剂的效能和扩散范围。
  • 可同时测试多个样品。
• 局限性：
  • 仅适用于溶出型抗菌剂。对非溶出型（接触型）抗菌剂无效（因其无法在琼脂中扩散形成抑菌圈）。
  • 结果受多种因素影响：琼脂厚度、浓度、接种菌量、样品贴附紧密度、培养条件等，需严格控制。
  • 抑菌圈大小主要反映抗菌剂的扩散速率和抑制能力，不能直接等同于实际使用环境下的长期抗菌耐久性或杀菌率。
  • 测量存在主观性，需规范操作。

七、相关标准参考

• ISO 20645:2004 纺织品 抗菌活性的测定 琼脂扩散平板试验
• AATCC 147-2016 纺织品的抗菌性评估：平行划线法（定性方法，与抑菌圈类似）
• JIS L 1902:2015 纺织品抗菌性能试验方法（包含抑菌圈法）
• GB/T 20944.1-2007 纺织品 抗菌性能的评价 第1部分：琼脂平皿扩散法

八、关键注意事项

1. 无菌操作：全程在洁净环境（如生物安全柜）进行，严格无菌操作，防止污染。
2. 菌悬液浓度：准确调整并验证菌悬液浓度是结果可靠的关键。
3. 样品接触：确保样品与琼脂表面紧密、均匀接触，无气泡。
4. 培养条件：严格控制温度、湿度和时间。
5. 及时测量：培养结束后尽快测量抑菌圈，避免菌落过度生长影响判断。
6. 结果一致性：每个样品应做平行试验（通常≥3个平行），结果取平均值。

九、结论

抑菌圈测试是评价溶出型抗菌纺织品抗菌性能的重要定性及半定量方法。它为筛选抗菌剂、比较不同纺织品抗菌效果提供了快速、直观的手段。然而，理解其适用范围（仅溶出型）和局限性至关重要。在实际应用中，常需结合其他定量方法（如吸收法、振荡烧瓶法）以全面评估纺织品的抗菌性能（包括杀菌率、抑菌率和耐久性）。严格遵守标准操作规程和设置合理的对照，是获得可靠、可重复测试结果的基础。

示意图：抑菌圈测试结果示意图

• 中心圆圈：测试样品（抗菌纺织品），紧密贴于琼脂表面。
• 紧邻样品的透明环：抑菌圈。此区域内，从样品中溶出并扩散的抗菌剂浓度足以抑制测试微生物的生长，因此没有肉眼可见的菌苔形成，呈现透明或半透明状态。
• 抑菌圈外围的不透明区域：菌苔生长区。此区域距离样品较远，抗菌剂浓度低于有效抑菌浓度（MIC），因此测试微生物可以正常生长繁殖，形成一层致密或不透明的菌苔。

测量方法：通常使用游标卡尺或电子测量仪，测量抑菌圈的总直径（从样品一侧边缘到另一侧边缘，穿过透明区的最大距离）。有时也报告抑菌圈宽度（(总直径 - 样品直径)/2）。