抗菌剂对铜绿假单胞菌杀菌试验

发布时间：2025-07-01 18:33:48 阅读量：3 作者：生物检测中心

抗菌剂对铜绿假单胞菌杀菌效力评估：方法与分析

摘要：
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为一种广泛存在于环境中的革兰氏阴性条件致病菌，因其对多种抗菌剂及消毒剂具有天然或获得性耐药性，成为医院感染和医疗器械相关感染的重要病原体之一。评估抗菌剂对其杀灭效力对于感染控制、医疗器械消毒及公共卫生安全至关重要。本研究旨在阐述评估抗菌剂对铜绿假单胞菌杀菌效力的标准试验方法、结果解读及其意义。

关键词： 铜绿假单胞菌；抗菌剂；杀菌效力；最小杀菌浓度；杀菌率；时间-杀菌曲线；生物膜；消毒效果评估

一、 引言

铜绿假单胞菌以其强大的环境适应能力、形成生物膜的能力以及多种耐药机制（如外膜通透性低、主动外排泵系统、产生灭活酶等）而著称。它能引起包括肺炎（尤其是呼吸机相关肺炎）、尿路感染、烧伤创面感染、血流感染及眼部感染等多种严重疾病。由于其耐药性问题突出，筛选和验证能有效杀灭铜绿假单胞菌的抗菌剂（包括化学消毒剂、防腐剂及某些具有抗菌性能的材料表面）显得尤为重要。科学、规范的杀菌效力试验是评价抗菌剂实际应用价值的基础。

二、 试验材料与方法

  1. 试验菌株：

    • 标准菌株： 通常选用国际公认的标准菌株，如ATCC 15442、ATCC 27853等，其生物学特性稳定，用于试验的重复性和可比性。
    • 临床分离株： 根据研究目的，可纳入近期临床分离的、具有特定耐药谱或多重耐药性的铜绿假单胞菌菌株，以评估抗菌剂对流行耐药菌株的效果。
    • 生物膜状态菌株： 如需评估抗菌剂对生物膜的清除效果，需预先在特定载体（如微量滴定板孔、医用导管片段、玻片）上培养形成成熟生物膜。

  2. 抗菌剂：

    • 待测抗菌剂需明确其类型（如季铵盐类、醇类、含氯消毒剂、过氧化物类、胍类、金属离子及其化合物、天然提取物等）。
    • 试验前需根据产品说明或预试验结果，用无菌去离子水或特定稀释液配制一系列不同浓度的测试液。通常设置一个较宽的浓度梯度范围，以涵盖预期的有效浓度。

  3. 培养基与试剂：

    • 营养肉汤（如TSB）： 用于菌种活化、增菌培养及时间-杀菌曲线试验。
    • 营养琼脂（如TSA）： 用于倾注平板法测定活菌数（菌落形成单位，CFU）。
    • 中和剂： 选择能有效中和待测抗菌剂活性且对细菌无毒性的中和剂（如硫代硫酸钠中和含氯消毒剂、卵磷脂吐温80中和季铵盐类等），用于终止抗菌剂作用并防止残留抗菌剂在培养过程中继续发挥作用。中和剂验证试验是杀菌试验的关键步骤。
    • 磷酸盐缓冲液（PBS）： 用于菌悬液的稀释、洗涤等。
    • 结晶紫染色液、乙醇等： 用于生物膜定量分析（可选）。

  4. 主要试验方法：

    • 最小杀菌浓度测定：

      • 将活化后的铜绿假单胞菌用液体培养基调整至一定浊度（如0.5麦氏单位），制备成菌悬液。
      • 在无菌试管或微孔板中加入不同浓度的抗菌剂溶液及等量菌悬液，混合均匀，使最终菌浓度通常为10^5 - 10^6 CFU/mL。
      • 在特定温度（如35±2°C）下孵育一定时间（根据抗菌剂性质和应用场景设定，常见如5分钟、10分钟、30分钟、1小时、24小时等）。
      • 到达作用时间后，立即吸取混合液加入含有足量中和剂的溶液中，充分混匀，终止反应。
      • 将中和后的混合液进行适当梯度稀释（通常10倍系列稀释）。
      • 取适量稀释液，采用倾注平板法或涂布平板法接种于营养琼脂平板上。
      • 在适宜温度下倒置培养24-48小时。
      • 计数平板上生长的菌落数。MBC定义为在该浓度和作用时间下，能够杀灭≥99.9%（即3 log10）初始接种菌量的最低抗菌剂浓度。

    • 杀菌率计算：

      • 基于MBC试验或其他定量杀菌试验中获得的活菌计数结果。
      • 杀菌率（%） = [(初始平均活菌数 - 作用后平均活菌数) / 初始平均活菌数] × 100%。
      • 杀灭对数值（Log Reduction） = Log10(初始平均活菌数) - Log10(作用后平均活菌数)。杀灭对数值≥3（即99.9%）通常被认为是有效的杀菌效果。

    • 时间-杀菌曲线：

      • 在含有特定浓度抗菌剂的液体培养基中接种铜绿假单胞菌（通常起始菌量为10^5 - 10^6 CFU/mL）。
      • 在设定的不同时间点（如0, 5min, 15min, 30min, 1h, 2h, 4h, 6h, 24h等），取样并立即加入中和剂溶液中。
      • 对中和后的样品进行稀释和活菌计数（倾注平板法）。
      • 以作用时间为横坐标，以存活菌数的对数值（Log10 CFU/mL）为纵坐标，绘制杀菌动力学曲线。该曲线能直观反映杀菌速度（斜率）和最终杀菌程度（平台期）。

    • 生物膜杀菌/清除试验：

      • 在载体上培养形成成熟生物膜（通常需24-72小时）。
      • 用PBS轻轻洗涤以去除浮游菌。
      • 将载体浸入不同浓度的抗菌剂溶液中作用特定时间。
      • 作用结束后，取出载体，可用PBS洗涤（根据方法学要求）。
      • 活菌计数法： 将载体转移至含有中和剂和玻璃珠的试管中，充分振荡或超声处理以分散生物膜，然后进行稀释和活菌计数。
      • 染色定量法（如结晶紫法）： 用结晶紫染色生物膜，乙醇溶解染料后，测定吸光度值，间接反映生物膜量。需设立未处理对照组。
      • 评价指标：生物膜内活菌数的减少（Log Reduction）或生物膜生物量的减少率。
 

三、 结果分析与解读

  1. 效力评价标准：

    • 根据不同应用场景（如医疗器械高水平消毒、皮肤黏膜防腐、环境表面消毒），行业或国家标准通常规定了针对特定指示菌（包括铜绿假单胞菌）的最低杀菌要求。例如，对于高水平消毒剂，要求在特定浓度和作用时间下，对铜绿假单胞菌等细菌芽孢和分枝杆菌达到≥6 log10的杀灭效果；对营养体细菌（包括铜绿假单胞菌）要求≥5 log10。
    • MBC值越低，表明该抗菌剂在较低浓度下即具有强杀菌力。
    • 杀菌曲线下降越快、平台期活菌数越低，表明杀菌速度越快、效力越强。
    • 生物膜试验结果需与浮游菌试验结果对比，通常生物膜状态下的细菌对抗菌剂的抵抗力显著增强。

  2. 关键影响因素：

    • 抗菌剂浓度： 浓度是影响杀菌效果的最主要因素之一，通常浓度越高，杀菌效果越好。
    • 作用时间： 杀菌效果随作用时间延长而增强，直至达到平台期。达到规定杀菌率所需的最短时间至关重要。
    • 有机物负荷： 试验中加入一定浓度的有机干扰物（如小牛血清、酵母浸膏），模拟实际使用环境（如血液、脓液、痰液存在下），评估抗菌剂在“脏”条件下的效力。
    • 温度： 温度升高通常有利于提高杀菌速度。
    • pH值： 某些抗菌剂的活性受pH值影响显著。
    • 菌株特性： 不同来源（标准株vs临床株）、不同耐药谱、是否形成生物膜的菌株，对抗菌剂的敏感性存在差异。
    • 菌量（接种量）： 初始菌量越大，达到相同杀菌率所需的抗菌剂效力或作用时间可能越长。

  3. 结果意义：

    • 筛选有效抗菌剂： 为特定用途（如手消毒、器械浸泡消毒、表面擦拭消毒、抗感染材料）筛选出对铜绿假单胞菌有高效杀灭作用的产品或配方。
    • 确定使用参数： 为抗菌剂的实际应用提供关键参数依据，如推荐使用浓度、最短作用时间、适用温度范围等。
    • 评估耐药风险： 通过比较对不同菌株（特别是耐药株）的效力，初步评估该抗菌剂诱导耐药或对现有耐药菌是否有效的可能性。
    • 指导产品研发与改进： 为新型抗菌剂或改良配方的研发提供效果反馈。
    • 符合法规要求： 满足消毒产品上市或医疗器械抗菌涂层评价的法规检测要求。
 

四、 讨论

  • 浮游菌与生物膜： 常规杀菌试验主要针对浮游菌，但铜绿假单胞菌在医疗器械表面、慢性感染病灶（如囊性纤维化患者肺部）极易形成生物膜。生物膜为其提供了强大的物理和生理屏障，使其对抗菌剂的耐受性可提高数十至上千倍。因此，评估抗菌剂对生物膜的渗透和清除能力对于防控其相关感染具有特殊重要性。专门针对生物膜的杀菌试验模型（如静态微孔板法、动态生物膜反应器法）应被纳入更全面的评估体系。
  • 中和剂的重要性： 中和剂选择不当或验证不充分，会导致残留抗菌剂继续抑制细菌生长，造成“假阴性”（即高估杀菌效果）或干扰生物膜分散。严格的中和剂效能验证试验是确保杀菌试验结果准确可靠的前提。
  • 与实际应用的关联性： 实验室条件下的标准化试验是基础，但实际应用环境更为复杂多变（如不同材质表面、有机污染物种类和浓度、水流冲刷、光照、温度波动等）。在解读实验室结果和制定使用指南时，需充分考虑这些差异，有时需要进行模拟现场或现场试验作为补充。
  • 持续监测： 细菌的耐药性会不断演变。即使某抗菌剂在上市初期对铜绿假单胞菌高效，也需定期监测其在临床使用环境中的持续有效性，警惕耐药菌株的出现。
 

五、 结论

抗菌剂对铜绿假单胞菌的杀菌效力评估是一项系统而严谨的工作，涉及标准化的试验方法（如MBC测定、时间-杀菌曲线）、严格的质量控制（特别是中和剂验证）以及对关键影响因素（浓度、时间、有机物、生物膜状态等）的全面考量。通过科学规范的杀菌试验，可以筛选出有效的抗菌解决方案，为其在医疗感染控制、公共卫生消毒及抗菌材料等领域的合理应用提供关键数据支持，对于降低铜绿假单胞菌相关感染风险和保障公共卫生安全具有重要意义。持续关注其对生物膜的效力及潜在的耐药性发展是未来研究的重要方向。

参考文献：

  1. Association of Official Analytical Chemists (AOAC) International. Official Methods of Analysis. (具体方法号需参考最新版本，如针对消毒剂的杀菌试验方法).
  2. European Committee for Standardization (CEN). EN standards related to chemical disinfectants and antiseptics (e.g., EN 1040, EN 1276, EN 13697, EN 1499, EN 1500). (具体标准号需根据测试类型选择).
  3. United States Environmental Protection Agency (EPA). Product Performance Test Guidelines. OCSPP 810.2200: Disinfectants for Use on Environmental Surfaces. Guidance for Efficacy Testing.
  4. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods for Determining Bactericidal Activity of Antimicrobial Agents; Approved Guideline M26-A. CLSI, Wayne, PA.
  5. ASTM International. Standard Test Method for Evaluation of the Effectiveness of Healthcare Personnel or Consumer Handwash Formulations (ASTM E1174). Standard Test Method for Evaluation of Antibacterial Soaps (ASTM E2276). (其他相关标准).
  6. 中华人民共和国国家标准. 消毒技术规范. (最新版本).
  7. Hall, C. W., & Mah, T. F. (2017). Molecular mechanisms of biofilm-based antibiotic resistance and tolerance in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews, 41(3), 276–301.
  8. McDonnell, G., & Russell, A. D. (1999). Antiseptics and disinfectants: activity, action, and resistance. Clinical Microbiology Reviews, 12(1), 147–179.
 

(注意：参考文献中标准的具体编号需根据实际采用的试验方法进行更新和补充)