生物指示剂缩短培养时间鉴定试验

发布时间：2025-07-01 16:09:16 阅读量：2 作者：生物检测中心

生物指示剂缩短培养时间鉴定试验：原理、方法与验证

摘要： 生物指示剂（Biological Indicators, BIs）是验证灭菌工艺有效性的核心工具。传统培养时间（通常7天）旨在确保所有潜在受损微生物得以复苏生长。本试验旨在科学验证特定类型BI在更短培养时间（如24或48小时）下，能否可靠判定灭菌失败（阳性），从而在不牺牲可靠性的前提下显著提升灭菌验证效率。

一、 引言

BIs含有对特定灭菌方式具有高度抵抗力的标准微生物（如湿热灭菌用嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子）。灭菌后，BI经培养，若微生物复苏生长（阳性），表明灭菌失败；若无生长（阴性），表明灭菌过程有效。缩短培养时间对需要快速放行产品（如医疗器械、无菌灌装线）的行业意义重大，能加速批放行、减少库存、提升生产效率。但此缩短必须建立在严谨科学验证的基础上，确保与标准培养时间等效。

二、 试验原理

缩短培养时间鉴定的核心原理是：

  1. 受损微生物的快速复苏： 灭菌后存活的孢子（或微生物）若受到亚致死损伤，其复苏和生长速度是关键。验证需证明在目标缩短时间内，所有具有生长潜力的受损孢子均能复苏并产生可检测的生长。
  2. 统计学等效性： 通过比较大量样品在缩短时间点和标准培养终点的结果，运用统计学方法证明两者在阳性检出率上无显著差异（尤其是在低存活水平下），且缩短时间点的阴性结果能可靠预测最终阴性结果。
  3. 模型建立： 基于微生物生长动力学和概率模型，证实目标缩短时间足以涵盖最慢生长微生物的复苏和增殖至可检测水平所需时间。
 

三、 试验材料与方法

  1. 生物指示剂： 明确使用的BI类型（自含式BI、孢子条+培养基）、载体材质、标示菌种、初始染菌量（如 10⁶ CFU/单位）及D值（已验证）。

  2. 灭菌设备： 明确灭菌类型（蒸汽、干热、环氧乙烷、VH₂O₂等）及试验所用具体设备。

  3. 培养基与培养条件： 使用BI制造商规定或经验证适用于该菌种的专用培养基。明确培养温度（如嗜热脂肪地芽孢杆菌用55-60°C，萎缩芽孢杆菌用30-35°C）。

  4. 试验设计核心：

    • 样品处理： 将BI分成若干组。
    • 亚致死处理： 对BI进行精确控制的亚致死灭菌处理（如暴露于低于验证过的灭菌剂量的条件下），目标是产生一定比例（如0.1%到10%）的阳性BI样品，模拟灭菌失败的边缘情况。这是试验的关键环节，需要精确控制剂量以获得预期的低阳性率。
    • 培养与观察：
      • 对所有亚致死处理后的BI进行培养。
      • 在目标缩短时间点（Tₛ，如24h, 48h） 读取结果并记录（阳性/阴性）。
      • 继续培养至标准培养时间（T꜀，如7天） 再次读取结果作为最终结果（金标准）。
    • 对照组：
      • 阳性对照组： 未灭菌BI全部应为阳性（Tₛ和T꜀）。
      • 阴性对照组： 完全灭菌BI（使用常规灭菌剂量过度杀灭）全部应为阴性（Tₛ和T꜀）。

  5. 样本量： 样本量必须充足以满足统计学要求。常基于二项分布或超几何分布计算，以确保有足够把握度检出设定水平（如存活率0.1%）的阳性。通常每组需要数百甚至上千个BI样品。

 

四、 数据分析与可接受标准

  1. 数据整理： 记录每个BI在Tₛ和T꜀的阴阳性结果。
  2. 关键指标计算：
    • 假阴性率（FNR）@ Tₛ： 在Tₛ判为阴性，但在T꜀判为阳性的样品数 / T꜀总阳性样品数。这是最重要的指标。
    • 假阳性率（FPR）@ Tₛ: 在Tₛ判为阳性，但在T꜀判为阴性的样品数 / T꜀总阴性样品数（通常应极低或为0）。
    • Tₛ阴性的预测阴性符合率： Tₛ判为阴性的样品中，在T꜀仍为阴性的比例（应接近100%）。
    • Tₛ阳性的预测阳性符合率： Tₛ判为阳性的样品中，在T꜀仍为阳性的比例（应接近100%）。
  3. 可接受标准（示例，需根据风险评估设定）：
    • 核心要求：假阴性率（FNR）@ Tₛ 必须为 0%。即，所有在标准培养时间（T꜀）最终显示为阳性的样品（代表灭菌不完全），都必须在缩短时间点（Tₛ）被准确检出为阳性。不允许有任何遗漏。
    • 假阳性率（FPR）@ Tₛ ≤ 预设值（如1%或更低）。
    • Tₛ阴性的预测阴性符合率 ≥ 99.9% (或基于风险设定更高要求)。
    • Tₛ阳性的预测阳性符合率 ≥ 99% (通常较高)。
    • 阳性对照组在Tₛ和T꜀必须100%阳性。
    • 阴性对照组在Tₛ和T꜀必须100%阴性。
  4. 统计学分析： 通常使用假设检验（如McNemar检验）比较Tₛ与T꜀结果的一致性，或计算置信区间来评估FNR/FPR。
 

五、 试验报告

报告应详细记录：

  1. 试验目的与背景。
  2. 使用的BI详细信息（型号、批号、菌种、染菌量、D值）。
  3. 灭菌设备与方法，亚致死处理的具体参数（剂量、时间、温度）。
  4. 培养基信息与培养条件（温度）。
  5. 试验设计（组别、样本量、处理方式）。
  6. 目标缩短时间（Tₛ）和标准时间（T꜀）。
  7. 所有原始数据（每个BI在Tₛ和T꜀的结果）。
  8. 计算结果（FNR, FPR, 预测符合率）。
  9. 统计学分析结果。
  10. 结论：明确目标缩短时间（Tₛ）是否通过验证，满足所有预设的可接受标准。说明该缩短时间适用的特定BI类型和灭菌工艺。
 

六、 应用注意事项

  1. 适用范围： 验证结果仅适用于该试验中使用的特定BI产品（型号、批号范围）、特定灭菌工艺和特定培养条件。更换BI品牌、型号、灭菌设备或培养基/培养温度，需重新验证。
  2. 阴性结果判定： 在缩短时间点（Tₛ）读取阴性结果后，仍需将BI继续培养至标准时间（T꜀） 进行最终确认。Tₛ的阴性结果用于早期决策（如设备放行、批次风险初步评估），但最终放行仍需基于T꜀的最终阴性结果（除非法规特别允许）。
  3. 阳性结果判定： 在缩短时间点（Tₛ）一旦观察到阳性结果，即可立即判定为灭菌失败，无需等待标准时间结束。这是缩短时间最主要的效益之一——快速识别失败。
  4. 变更控制： 任何可能影响BI性能或培养条件的变更（如BI生产工艺变更、培养基来源变更、培养箱变更），都应评估是否需要重新进行缩短培养时间验证。
  5. 法规符合性： 实施缩短培养时间方案前，应评估并确保符合相关GMP、药典（如USP 〈1035〉概述了BI的概念，实施需科学论证）及国家/地区法规指南的要求。通常需要提交充分的验证数据供监管机构审评。
 

七、 结论

生物指示剂缩短培养时间鉴定试验是一个严谨的、基于大量数据和统计分析的科学研究过程。成功验证后，能在确保不增加假阴性风险（即不漏检灭菌失败）的前提下，显著缩短获得初步灭菌结果（特别是阳性结果）的时间，优化工作流程，提高生产效率。然而，其实施必须建立在针对特定BI和特定工艺条件的充分科学验证基础之上，并遵循完善的变更控制和质量管理体系要求。最终阴性结果的判定仍需依赖完整的标准培养周期。