环氧乙烷灭菌生物指示剂测试

环氧乙烷灭菌生物指示剂测试：原理、应用与关键控制

环氧乙烷（EO）灭菌因其优异的穿透性及常温操作特点，被广泛用于不耐高温湿热的医疗器械（如电子设备、塑料制品、植入物）的终端灭菌。生物指示剂（BI）测试是验证和监控EO灭菌过程有效性的核心手段与黄金标准。

一、生物指示剂的核心作用与工作原理

1. 定义与本质：

   • 生物指示剂是一种含有特定数量、高度耐受EO灭菌的标准化微生物孢子（通常为嗜热脂肪地芽孢杆菌）的制品。
   • 其本质是灭菌过程的直接挑战者，其被杀灭的程度直观反映灭菌工艺杀灭最具抵抗力微生物的能力。

2. 核心作用：

   • 灭菌工艺验证： 新工艺开发或重大变更时，证明设定的灭菌参数（浓度、温度、湿度、时间）能稳定杀灭指示微生物。
   • 周期性再验证： 定期（如半年或年度）确认灭菌设备及工艺参数持续处于有效受控状态。
   • 常规灭菌周期监控： 每次灭菌周期或按预定频率放置，作为日常运行有效性的直接生物学证据。
   • 设备性能确认： 评估灭菌设备（如柜体泄漏、循环均匀性）的性能。
   • 装载模式确认： 验证特定产品装载方式是否影响灭菌剂的有效穿透和分布。

3. 工作原理：

   • 挑战性： 所选孢子在特定条件下对EO的抵抗力必须显著高于产品上可能存在的自然微生物污染菌（包括潜在的病原体）。
   • 量化性： 每支BI含有已知数量（通常为10^5至10^6 CFU）的孢子，为量化杀灭效果提供基础。
   • 一致性： 标准化生产和质检确保BI性能（如D值、孢子数量）高度稳定可靠。
   • 指示性： BI在灭菌周期中经历与实际产品相同的环境。灭菌后培养结果（生长/不生长）直接反映设定的灭菌参数是否足以杀灭指示孢子，从而推断产品无菌保证水平（SAL ≤ 10^-6）是否达成。

二、标准化生物指示剂的类型与关键特性

1. 常见类型：

   • 自含式生物指示剂： 最常用。孢子条与无菌培养基（含pH指示剂）集成于同一塑料管或玻璃管内。灭菌后压碎内管即可开始培养。操作简便，减少污染风险。
   • 可剥离式孢子条： 孢子附着在载体（如纸条、不锈钢片）上。灭菌后需在无菌条件下转移至单独培养基管中培养。灵活性高，可放置于器械内部等特殊位置。
   • 快速读取生物指示剂： 基于检测孢子萌发过程中的代谢产物（如荧光），可在1-4小时内初步判读结果，但仍需传统培养（如48小时）确认。

2. 关键特性参数：

   • 指示微生物： 主要为嗜热脂肪地芽孢杆菌 ATCC 7953 或等效菌株。其对EO的耐受性是公认的标准。
   • 载体： 纸质或金属片，需确保孢子牢固附着且不影响EO穿透。
   • 孢子数量： 每单位BI在有效期内标示的活孢子数通常为 1 x 10^5 到 5 x 10^6 CFU（常用1 x 10^6）。初始数量是计算杀灭效果的基础。
   • D值： 在特定EO浓度、温度、湿度条件下，杀灭90%孢子所需的时间（分钟）。这是衡量孢子抵抗力和计算灭菌暴露时间的关键参数。BI制造商需提供标定的D值。
   • Z值： 使D值变化10倍所需的温度变化（℃）。用于评估温度波动对灭菌效果的影响（EO灭菌中Z值应用相对较少）。
   • 贮存稳定性与有效期： BI需在指定条件下（常为2-8°C避光）贮存，并在有效期内使用，确保孢子数量稳定且复苏率高。
   • 复苏率： 未灭菌的BI在培养后应表现出高复活率（通常≥ 95%），证明孢子活性良好。

三、生物指示剂测试的标准操作规程

1. 测试前准备：

   • 选择与确认： 选用符合ISO 11138-2标准的BI。核实其有效期、贮存条件、孢子数量、D值信息。
   • BI预处理： 严格按说明书操作（如平衡至室温）。避免剧烈震动或污染。
   • 放置策略制定：
     • 验证测试： 根据灭菌柜容积和装载特点，在最难灭菌位置（通常为灭菌剂最难穿透、温湿度最低处，如大型器械中心、管道内部、紧密包装物中心、排水口附近柜壁）合理分布足够数量的BI。需进行空载和装载热分布/热穿透研究确定冷点。
     • 常规监控： 至少在每个灭菌柜的代表性位置放置一支BI（通常也在疑似冷点）。关键产品/装载可增加数量或放置在产品内部。
   • 阳性对照与阴性对照：
     • 阳性对照： 选取一支未灭菌的同批次BI，单独存放（不与灭菌物品同柜），灭菌后与测试BI一同培养。必须显示阳性（生长），证明培养基无菌性、培养条件适宜且孢子具有活性。
     • 阴性对照： 一支未接种的培养基或灭菌后的空白培养基。必须显示阴性（不生长），证明培养基本身无菌。
   • 灭菌参数设定： 严格按照经过验证的灭菌程序执行（包括预处理、加湿、灭菌、排气、解析各阶段参数）。
   • 装载： 按经过验证的模式装载产品，BI应放置在设计好的预定位置，不应阻碍灭菌剂循环。

2. 灭菌过程执行：

   • 启动灭菌程序，确保所有关键参数（EO浓度、温度、湿度、压力、时间）被准确记录和监控。

3. 灭菌后处理：

   • 安全操作： 遵循安全规程处理残留EO（充分通风、佩戴防护装备）。
   • BI取出： 在无菌区域或尽量减少污染风险的环境下，小心取出BI。
   • BI处理：
     • 自含式： 压碎/激活内管培养基，使培养基浸没孢子条。
     • 孢子条： 在无菌条件下将孢子条转移至装有新鲜无菌培养基的试管中。
     • 快速读取： 按说明书激活并放入专用阅读器开始监测。

4. 培养与结果判读：

   • 培养条件： 按BI说明书要求（通常嗜热脂肪地芽孢杆菌需在55-60°C培养），确保培养箱温度准确稳定。
   • 培养时间： 标准培养时间为48小时或按说明书要求（快速读取BI按设备要求判读，但最终确认需传统培养）。
   • 结果判读：
     • 阴性（通过）： 培养基未变色（如保持紫色）且澄清无浑浊，指示灭菌周期内所有测试BI中的孢子均被杀灭。
     • 阳性（失败）： 培养基变色（如变为黄色）和/或出现浑浊，指示至少有一个测试BI中有孢子存活。
   • 对照确认：
     • 阳性对照必须为阳性（生长）。
     • 阴性对照必须为阴性（不生长）。
     • 只有对照结果符合预期，测试结果才有效！

四、结果分析、处理与报告

1. 测试通过：

   • 所有测试BI均为阴性。
   • 阳性对照阳性，阴性对照阴性。
   • 结论：该灭菌周期在测试条件下被判定为有效。

2. 测试失败：

   • 一个或多个测试BI结果为阳性。
   • 至关重要：立即启动偏差调查！
   • 调查范围： 检查所有可能原因：
     • 灭菌过程参数： 检查记录的温度、湿度、压力、EO浓度、时间是否偏离设定值？设备是否有故障（阀门泄漏、传感器失灵、循环不均匀）？
     • BI因素： BI是否过期？贮存不当？运输受损？放置位置错误（如暴露于冷凝水）？阳性对照结果是否正常（排除BI本身问题）？
     • 装载因素： 装载是否超出验证范围？是否阻塞了灭菌剂穿透？产品包装是否改变？
     • 培养因素： 培养箱温度是否正确？培养时间是否足够？培养基是否失效？操作过程是否导致BI意外污染？
     • 实验室错误： 判读错误？记录错误？
   • 受影响批次处理： 在调查完成并确认原因前，该次灭菌周期处理的所有产品必须被隔离，不得放行！ 通常需要进行产品无菌测试（抽样量极大，可靠性远低于BI测试），并根据调查结果评估风险，决定产品报废或重新灭菌（需充分评估对产品性能的影响）。
   • 纠正与预防措施： 根据根本原因制定并实施CAPA，如维修设备、修改程序、加强人员培训、调整装载模式、更换BI批次或供应商等。通常需要进行再验证，证明问题已解决且工艺恢复有效状态。
   • 完整记录： 详细记录偏差现象、调查过程、分析结果、采取的措施及结论。

五、质量控制与法规符合性

1. 遵循核心标准：

   • ISO 11135: 医疗器械环氧乙烷灭菌过程确认和常规控制的核心标准。详细规定了工艺开发、确认（安装IQ、运行OQ、性能PQ）和常规监控的要求，BI测试是其中的关键环节。
   • ISO 11138系列： 专门规范生物指示剂生产、性能测试和质量控制的标准。
   • ISO 14161: 提供灭菌生物指示剂在灭菌工艺开发、确认和控制中的应用指南。
   • 各国法规： 如FDA QSR/cGMP、欧盟MDR/IVDR等均要求建立并遵循验证过的灭菌程序，并有效监控。

2. 关键质量控制点：

   • BI采购与验收： 从合格供应商采购，查验COA（分析证书），核实是否符合ISO 11138-2。
   • BI贮存与管理： 严格控制贮存条件（温度、湿度、避光），遵循先进先出原则，定期检查库存状态。
   • 人员培训： 操作人员需全面理解BI原理、操作规程、安全要求、结果判读及偏差处理流程。
   • 设备校准： 培养箱、温度记录仪、灭菌设备传感器等需定期校准，确保数据准确可靠。
   • 记录完整性： 详细记录BI批次号、放置位置、灭菌参数、培养条件、判读结果（附照片）、对照结果、操作者、日期等所有信息。记录必须清晰、准确、完整、可追溯。
   • 定期审计： 定期审核BI测试流程和相关记录，确保符合SOP和标准要求。

六、重要注意事项与局限性

1. 非实时监控： BI测试是灭菌后的回顾性测试，结果滞后（通常需48小时以上）。
2. 抽样风险： BI放置在特定点，无法保证覆盖灭菌柜内每一个点或每一件产品内部。科学的放置策略（尤其在验证阶段）至关重要。
3. 仅指示特定微生物： 仅验证对嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的杀灭效果，虽代表强抗力，但不能直接证明对其他潜在污染微生物的有效性。
4. 不能取代物理监测： 必须与灭菌过程中连续记录的物理参数（温度、压力、浓度、时间）监控结合使用。物理参数是过程可控的基础，BI是生物学有效性的最终证明。
5. 安全第一： 严格遵守EO操作安全规程，防止泄露、爆炸和人员中毒。正确处理灭菌后残留EO和废液。

结论

环氧乙烷灭菌生物指示剂测试是确保医疗器械最终无菌，保障患者安全的不可或缺的环节。其有效性建立在标准化的指示剂产品、科学严谨的测试流程（包括关键的对照设置）、规范的操作、及时的偏差处理和全面的记录基础之上。深入理解其原理、严格遵守相关国际标准（ISO 11135, ISO 11138系列）和良好实践，是医疗器械制造商和灭菌服务提供商确保产品无菌质量、满足法规要求的基石。通过持续的质量控制和人员培训，BI测试将持续为无菌医疗器械的安全性和有效性提供强有力的生物学证据。