V79细胞基因突变试验

发布时间：2025-07-01 15:40:56 阅读量：3 作者：生物检测中心

V79细胞基因突变试验：原理与应用

一、引言

遗传毒性评价是化合物安全评估的核心环节，旨在识别可能损害DNA并诱发基因突变、染色体畸变等遗传物质改变的物质。体外哺乳动物细胞基因突变试验因其相对高效、可控和经济的特点，在该领域中占据重要地位。其中，中国仓鼠肺成纤维细胞（V79细胞）基因突变试验（通常称为V79/HGPRT或V79/TK试验）是广泛采用且历史悠久的经典方法之一，主要用于检测由化学物质或物理因素诱导的基因水平点突变。

二、基本原理

V79细胞基因突变试验的核心原理在于检测特定基因位点（通常为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因或胸苷激酶基因）的功能性失活突变。其核心机制是利用“正向选择系统”：

  1. 靶基因功能与毒性抗性：

    • HGPRT基因： 编码次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，该酶参与嘌呤补救合成途径。正常细胞（HGPRT⁺）能利用培养基中的次黄嘌呤（或鸟嘌呤）。
    • TK基因： 编码胸苷激酶，该酶参与嘧啶补救合成途径。正常细胞（TK⁺）能利用培养基中的胸苷。

  2. 选择性培养基的作用：

    • 在试验的选择培养阶段，向培养基中加入特定的毒性核苷类似物：
      • 针对HGPRT位点：加入6-巯基鸟嘌呤或6-硫代鸟嘌呤。HGPRT酶会将这些类似物磷酸化，掺入DNA，导致细胞死亡。只有发生HGPRT基因功能性突变的细胞（HGPRT⁻），因酶失活无法活化这些类似物，从而能在含毒物的培养基中存活并形成克隆。
      • 针对TK位点：加入三氟胸苷。TK⁺细胞将其磷酸化，掺入DNA致死；只有TK⁻突变细胞才能存活形成克隆。

  3. 突变频率的计算：

    • 突变频率 = （选择性培养基中突变克隆数 / 接种细胞数） / （非选择性培养基中总克隆形成率）
    • 该频率反映了受试物诱导特定基因位点发生可遗传、功能性突变的能力。
 

三、试验材料与细胞系

  • 细胞系： V79细胞系源自中国仓鼠肺组织，是贴壁生长的成纤维细胞。其特点包括：核型相对稳定、倍增时间短（约12-16小时）、克隆形成率高（常>70%），且具有功能性HGPRT和TK基因（用于对应试验）。
 

四、标准试验流程

  1. 细胞准备： 在适宜培养基中常规培养V79细胞，保持对数生长期状态。
  2. 细胞毒性预试验：
    • 用不同浓度受试物处理细胞（通常24-48小时）。
    • 测定细胞存活率（常用相对集落形成率评估）。
    • 确定正式试验的剂量范围（通常选择引起约10%-90%细胞存活抑制的浓度）。
  3. 正式突变试验（以HGPRT为例）：
    • 处理期： 将一定数量（通常约1×10⁶）的细胞暴露于不同浓度的受试物、溶剂对照（阴性对照）和已知致突变剂（阳性对照，如乙基亚硝基脲ENU或甲基甲烷磺酸酯MMS）中。处理时间通常为3-6小时（加和不加代谢活化系统）或24小时（通常不加代谢活化系统）。
    • 代谢活化： 如需评估需代谢活化的致突变物，在处理期间需加入外源性代谢活化系统（最常用的是经酶诱导剂处理的大鼠肝脏制备的S9混合液）。
    • 表达期： 处理结束后，洗去受试物，细胞在正常培养基中传代培养约7-10天（针对HGPRT位点）。此阶段至关重要：
      • 让受试物引起的DNA损伤得以“固定”为稳定的突变。
      • 稀释并降解处理时已存在于细胞中的功能性HGPRT酶（残余酶活性可能导致假阴性）。期间可能需要传代2-3次以维持细胞处于对数生长期。
    • 接种与选择培养：
      • 表达期结束后，胰酶消化制备单细胞悬液，准确计数。
      • 测定克隆形成率（存活率）： 将适量细胞接种于不含选择性药物的完全培养基中，培养约7天（形成肉眼可见克隆），计算克隆形成率（接种细胞数/实际接种细胞数），评估受试物细胞毒性。
      • 测定突变频率： 将适量细胞（通常每个浓度点约1-5×10⁵细胞）接种于含6-硫代鸟嘌呤的选择性培养基中。同时设置溶剂对照和阳性对照。培养约7-10天。
  4. 克隆计数与数据处理：
    • 固定染色后，计数各培养皿中形成的、大小符合标准的克隆数。
    • 计算各处理组的突变频率。
    • 进行统计学分析（如趋势检验、剂量组与对照组比较），判断受试物是否引起突变频率的显著、剂量依赖性升高。
  5. 质量控制：
    • 阴性对照： 溶剂对照的突变频率应在本实验室历史背景范围内（通常HGPRT位点<2×10⁻⁶突变细胞）。
    • 阳性对照： 已知致突变剂必须诱导出显著升高的突变频率，证明试验系统有效性。
    • 代谢活化系统有效性： 使用需要代谢活化的阳性对照物（如环磷酰胺或苯并[a]芘）验证S9混合液的活性。
    • 细胞存活率： 最高剂量组的相对存活率通常不应低于10%（OECD指南要求），以保证有足够细胞用于突变选择。
 

五、应用价值

  • 遗传毒性初筛： 作为一套标准的体外遗传毒性筛选试验组合（常与Ames试验、体外染色体畸变试验组合使用）的重要组成部分，用于识别潜在遗传毒物。
  • 机制研究： 有助于研究化合物诱导基因突变的机制（如碱基置换、移码突变）。
  • 定量评估： 可提供突变频率的定量数据，用于剂量-反应关系分析。
 

六、局限性与注意事项

  1. 体外局限性： 缺乏完整的体内药代动力学、ADME（吸收、分布、代谢、排泄）过程和组织特异性。
  2. 靶基因局限： 仅检测特定常染色体基因位点（HGPRT或TK）的突变，可能遗漏作用于其他靶点或引起染色体水平改变的遗传毒性。
  3. HGPRT位点的限制： HGPRT基因位于X染色体（V79细胞为雌性来源，仅一条X染色体有活性），某些机制（如大片段缺失、影响邻近必需基因的突变）可能导致细胞死亡，造成HGPRT⁻突变体的漏检（即“遗传致死性”）。
  4. TK位点的优势： TK基因位于常染色体，可耐受更大范围的遗传损伤（如部分缺失、染色体丢失），能检测出HGPRT试验可能漏检的缺失型突变体。TK⁻/⁻表型需两个等位基因都失活。
  5. 代谢差异： 外源S9混合液不能完全模拟体内代谢。
  6. 假阳性/假阴性风险： 如细胞毒性过高、选择药物浓度不当、表达期不足或过长均可能导致错误结果。
  7. 克隆计数标准： 需制定明确的克隆大小计数标准并保持一致。
 

七、结论

V79细胞基因突变试验作为一项成熟可靠的体外遗传毒性测试方法，通过检测HGPRT或TK基因位点的功能性失活突变，为评估化学品、药品、化妆品等物质的潜在致突变性提供了关键数据。理解其原理、严格遵循标准化操作规程（SOP）并充分考虑其局限性对于准确解读试验结果至关重要。该试验的结果通常需要结合其他体外和体内遗传毒性试验以及一般毒性研究结果，进行综合性的风险评估，为保护人类健康和环境安全提供科学依据。

未来展望： 随着分子生物学技术的进步，基于V79细胞的试验方法也在不断发展，例如利用分子技术（如测序）分析突变谱，以更深入地了解致突变机制。同时，严格遵守国际协调的测试指南（如OECD 476）和良好实验室规范（GLP）对于保证数据的可靠性、重现性和全球接受度始终是核心要求。