阴道黏膜重复接触刺激试验规程
1. 引言
阴道黏膜重复接触刺激试验是评估医疗器械、卫生产品（如避孕器具、润滑剂、阴道给药装置、冲洗液、避孕套等）及重复使用的化学物质对阴道黏膜潜在局部刺激性的关键安全性评价方法。该试验模拟产品实际使用中的多次暴露情况，比单次暴露试验更能反映长期接触的风险，为产品安全性提供重要依据。
2. 试验目的
评价供试品在预期或合理可预见的重复接触条件下，对实验动物阴道黏膜产生的刺激性、腐蚀性或其他局部毒性作用的程度和可逆性。
3. 试验原理
- 模拟暴露： 在设定的试验周期内（通常至少连续5天），每日一次将供试品（或浸提液/稀释液）通过适当方式（如导管灌注或模拟使用）引入实验动物（通常为健康成年雌性家兔或大鼠）阴道内。
- 对照设置： 设立阴性对照组（使用生理盐水或合适的赋形剂）和/或阳性对照组（使用已知的轻度刺激物，如2%十二烷基硫酸钠溶液）。
- 观察与评估： 试验期间观察动物全身状况和局部反应（如分泌物、肿胀、红斑）。试验结束后处死动物，取阴道组织进行大体病理学观察和详细的组织病理学检查（盲法阅片），根据标准评分系统评估黏膜损伤程度（如上皮完整性、炎症细胞浸润、血管充血、水肿、糜烂/溃疡）。
4. 试验动物
- 种属： 首选健康成年雌性新西兰白兔（New Zealand White Rabbits），因其阴道解剖结构与人类有一定相似性且易于操作。在某些情况下或特定标准要求下也可能使用大鼠。
- 数量和分组： 每组应有足够数量的动物（通常≥3只），以满足统计学要求。包括供试品组、阴性对照组和阳性对照组。
- 饲养管理： 动物需在符合动物福利标准的设施中单笼饲养，提供适宜的环境（温度、湿度、光照周期）、标准饲料和水。试验开始前应有足够的适应期。
- 伦理学要求： 试验必须遵循“3R原则”（替代、减少、优化），并获得机构动物伦理委员会（IACUC）的批准。应尽量减少动物的痛苦和不适。
5. 供试品准备
- 按产品预期用途配制。固体产品可制成浸提液（用生理盐水或无血清培养基）；液体产品可直接使用或按临床相关浓度稀释；凝胶/膏体/泡沫等需确保其稠度适合阴道灌注（必要时使用专用器械模拟放置）。
- 所有供试品需无菌（除非其无菌性会影响测试特性）或进行无菌处理（如过滤除菌），pH值应调整为生理范围（约4.0-5.0）或记录实际pH值。
6. 试验操作流程
- 动物准备： 试验期间每日检测阴道分泌物状态（如使用阴道涂片评估动情周期），避免在动情期操作。操作前动物需禁食。
- 给药/暴露：
- 温和保定动物。
- 清洁外阴区域。
- 使用无菌、光滑的特制导管（如钝头软管）连接注射器。
- 轻柔地将导管插入阴道至适当深度（避免损伤子宫颈）。
- 缓慢注入规定体积（兔通常1-2mL，大鼠0.2-0.5mL）的供试品、阴性对照液或阳性对照液。
- 缓慢退出导管，保持动物仰卧位片刻（通常约1分钟）以防液体回流。
- 给药周期： 每日给药一次，连续给药至少5天（常见为5-10天，根据产品预期暴露周期而定）。记录每次给药时间。
- 临床观察：
- 全身状况： 每日至少观察一次动物死亡率、发病迹象、行为活动、摄食饮水情况、体重变化。
- 局部反应： 每次给药前和最后一次给药后规定时间点（如1、24、48小时），详细观察并记录阴道口及周围区域状况：
- 分泌物：有无、性质（浆液性、脓性、血性）、颜色、量。
- 红肿：有无红斑、水肿及其程度。
- 其他：溃疡、坏死、异常收缩或闭锁。
- 按标准评分量表（如Draize评分或其改良版）进行量化评分（0-4分）。
7. 病理学检查
- 安乐死与取材： 末次给药后规定时间点（通常24或48小时），用符合伦理的方法安乐死动物。完整取出阴道组织（常连带子宫颈和部分阴道前庭）。
- 大体病理学： 肉眼观察并记录阴道组织有无充血、出血、水肿、坏死、穿孔、粘连及其程度和位置。拍照记录。
- 组织病理学（核心指标）：
- 将阴道组织纵向切开，分成若干段，中性缓冲福尔马林固定≥24小时。
- 选取代表性区域（尤其肉眼异常处）制作石蜡切片，H&E染色。
- 由经验丰富的病理学家在不知分组情况下（盲法）阅片。
- 评估指标及评分（基于ISO 10993-10, 10993-23等标准）：
- 上皮层： 完整性（完整、变性、坏死、脱落）；厚度（增生/萎缩）；角质化。
- 炎症反应： 炎性细胞（多形核白细胞、淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞）浸润的数量、深度和密度；微脓肿形成。
- 血管变化： 充血、血管炎、出血。
- 间质反应： 水肿、纤维化/肉芽组织形成。
- 其他： 坏死深度、溃疡、异物反应（如有植入物材料）。
- 每个指标按严重程度评分（通常0=无，1=极轻微，2=轻度，3=中度，4=重度），计算总分或综合评估刺激等级。
8. 结果分析与评价
- 汇总各组动物临床观察评分、大体病理学发现和组织病理学评分。
- 采用适当的统计学方法（如非参数检验）比较供试品组与阴性对照组的差异。
- 结合阳性对照结果，判断试验系统的有效性。
- 评价标准（示例）：
- 无刺激性： 与阴性对照组相比，所有指标均无显著差异；组织学未见病理性改变。
- 极轻微/轻度刺激性： 短暂轻微红斑或分泌物，24小时内恢复；组织学可见轻微可逆性改变（如轻微充血、轻度表层上皮变性）。
- 中度刺激性： 明显红斑、水肿、分泌物，持续时间较长；组织学可见上皮损伤（如变性、局灶坏死脱落）、中度炎症浸润、充血水肿。
- 重度刺激性/腐蚀性： 严重红斑、水肿、分泌物、出血、坏死或穿孔；组织学可见广泛上皮坏死脱落、深部组织溃疡、剧烈炎症反应、血管损伤、坏死。
- 评价应明确损伤的性质、程度、范围及可逆性（如试验结束时是否观察到恢复迹象）。
9. 局限性
- 种属差异： 动物阴道环境（微生物群、pH、上皮结构）与人类存在差异，结果外推需谨慎。
- 机械效应： 给药操作本身可能造成轻微损伤，需通过合格的阴性对照组和操作技巧来区分。
- 敏感性： 可能无法检测出某些类型的延迟性刺激或低水平致敏反应。
- 伦理考量： 需要使用活体动物。
10. 报告内容
试验报告应详细透明，包括：
- 试验依据的标准（如ISO 10993-10, 10993-23, OECD TG 406或特定国家/地区标准）。
- 供试品信息（名称、批号、性状、浓度、pH、处理方式）。
- 动物信息（种属、品系、来源、数量、体重范围、饲养条件）。
- 试验设计（分组、剂量/浓度、体积、给药频率、周期、观察时间点）。
- 详细的操作方法（包括麻醉、给药技术）。
- 临床观察结果（个体和汇总数据、评分）。
- 病理学检查结果（大体描述、组织学评分表及代表性显微照片）。
- 结果统计分析。
- 结论性评价（刺激性分级）。
- 所有偏离方案的情况说明。
- 病理学家资质声明。
- 动物伦理批准号。
11. 结论
阴道黏膜重复接触刺激试验是评估产品阴道应用安全性的重要环节。通过严格控制试验条件、规范操作流程以及结合全面细致的临床和病理学评价，该试验能够有效识别和量化供试品对阴道黏膜的潜在刺激性风险，为产品上市前安全性评估和临床合理使用提供关键的科学依据。研究者应始终秉持严谨科学的态度并严格遵守动物伦理规范。