载体浸泡定性灭菌试验技术指南
一、引言
灭菌是医疗器械、药品生产、生物安全实验室等领域保障产品及环境安全的关键环节。载体浸泡定性灭菌试验是一种重要的实验室方法，主要用于评估液态化学灭菌剂（如戊二醛、过氧乙酸、含氯消毒剂等）在规定条件下杀灭载体上高抵抗力微生物（通常为细菌芽孢）的能力。该试验结果为灭菌剂的选择、使用浓度、作用时间的确定提供核心依据，对感染控制具有重大意义。
二、基本原理
模拟实际灭菌过程，将染有已知数量特定抗力微生物（生物指示剂）的载体（模拟物品表面），完全浸没于待测灭菌剂溶液中，在设定的温度下作用预定时间。作用结束后，通过中和残留灭菌剂并培养检测载体上微生物存活情况，定性判定该灭菌剂在规定条件下是否达到完全杀灭微生物（无菌生长）的灭菌效果。
三、试验材料与准备
- 待测灭菌剂： 按使用说明配制所需浓度的溶液，确保新鲜配制或处于有效期内。
- 试验微生物（生物指示物）： 选择国际公认的、对特定灭菌方式具有高抵抗力的标准菌株芽孢。
- 常用菌株： 嗜热脂肪地芽孢杆菌 (Geobacillus stearothermophilus) ATCC 7953 或 12980 芽孢（常用于蒸汽、化学蒸汽、环氧乙烷、过氧化氢等离子体及湿热敏感化学灭菌剂的抗力测试）；枯草芽孢杆菌黑色变种 (Bacillus atrophaeus) ATCC 9372 芽孢（常用于环氧乙烷、干热及部分化学灭菌剂的抗力测试）。
- 载体要求： 芽孢应稳定、均匀地染在惰性载体（如不锈钢片、玻璃片、聚四氟乙烯片、滤纸片、手术缝合线片段等）上，载体应不影响灭菌剂活性且易于操作。载体上芽孢量应达到
10⁵至10⁶CFU/载体。
- 中和剂： 必须能有效、及时地中和待测灭菌剂的残留活性，且自身及其与灭菌剂、中和产物的混合物对试验微生物无毒、无抑制生长作用。需预先验证中和剂有效性（中和产物培养试验、中和剂毒性试验、残留灭菌剂去除验证）。
- 培养基：
- 恢复培养基： 用于复苏可能受损的微生物（如胰酪大豆胨液体培养基 - TSB）。
- 生长培养基： 用于培养并观察微生物生长（如胰酪大豆胨琼脂培养基 - TSA）。
- 阳性对照： 将染菌载体不经灭菌剂处理，直接接种到含中和剂的恢复培养基中培养，应生长良好，证明试验微生物的存活力和培养条件有效性。
- 阴性对照：
- 培养基无菌对照： 所用培养基应无菌生长。
- 稀释液/冲洗液对照： 用于稀释或冲洗的液体（如缓冲液）应无菌。
- 中和剂无菌及毒性对照： 中和剂本身及中和剂+培养基应无菌且不抑制微生物生长。
- 灭菌剂载体对照： 将未染菌的载体与染菌载体一同浸泡、处理、培养，应无菌生长，排除载体污染或灭菌剂本身抑菌导致的假阴性。
- 器材： 无菌吸管、移液器及枪头、无菌培养皿、无菌试管、恒温水浴锅或烘箱（控温）、计时器、生物安全柜、培养箱等。
四、试验操作步骤
- 准备与分组：
- 准备足够数量的染菌载体（通常每组至少3个重复）。
- 设立试验组、阳性对照组、阴性对照组（培养基、稀释液/冲洗液）、灭菌剂载体对照组。
- 浸泡处理：
- 将试验组染菌载体完全浸没于盛有待测灭菌剂溶液（体积需足够大，确保载体完全浸泡且不影响浓度）的容器中。
- 立即开始计时。
- 将容器置于恒温水浴锅或烘箱中，维持设定的试验温度（如20°C, 25°C, 特定温度）。
- 到达设定的作用时间（如10min, 20min, 30min, 60min, 特定时间点）后，立即取出载体。
- 终止灭菌与中和：
- 迅速将载体转移至含有足量中和剂（已验证有效）的无菌容器（如试管）中。
- 可辅以轻微振荡或冲洗，确保残留灭菌剂被充分中和。
- 中和作用时间需根据验证确定（通常5-30分钟）。
- 转移与培养：
- 将经中和处理的载体（或取其冲洗液/浸泡液）转移至装有恢复培养基（通常是液体TSB）的试管中。
- 将试管置于适宜试验微生物生长的温度下培养（嗜热脂肪地芽孢杆菌通常55-60°C；枯草芽孢杆菌黑色变种通常30-37°C）。
- 阳性对照载体直接放入含中和剂的恢复培养基中培养。
- 阴性对照组：将无菌培养基、稀释液/冲洗液、中和剂+培养基等直接进行培养。
- 灭菌剂载体对照组：处理后的未染菌载体按试验组同样方式操作培养。
- 观察与记录：
- 培养期间（通常7天，部分标准要求14天或更长）定期观察培养基浑浊度（液体培养）或载体/琼脂表面是否有菌落生长。
- 详细记录各试验组、对照组在每个观察时间点的生长情况（浑浊/浑浊度、菌落有无/数量）。
五、结果判定
- 试验有效条件：
- 阳性对照：必须显示良好的微生物生长。
- 所有阴性对照（培养基、稀释液/冲洗液、中和剂、灭菌剂载体）：必须无菌生长。
- 定性灭菌效果判定：
- 灭菌合格（通过）： 在规定的培养观察期内（如7天），所有重复的试验组载体对应的培养物均无菌生长（培养液澄清无浑浊，或载体/琼脂无菌落）。
- 灭菌不合格（未通过）： 在规定的培养观察期内，任何一个重复的试验组载体对应的培养物出现微生物生长（培养液浑浊，或载体/琼脂上出现菌落）。
六、应用与注意事项
- 核心应用：
- 评价新型化学灭菌剂或新配方的灭菌效能。
- 验证特定灭菌剂在推荐使用浓度、温度、时间参数下是否能达到灭菌要求。
- 比较不同灭菌剂或不同参数组合的效果。
- 作为灭菌工艺开发和验证的初步筛选试验。
- 关键注意事项：
- 严格无菌操作： 整个试验过程须在生物安全柜或洁净环境下进行，防止外源性污染。
- 精确控制参数： 灭菌剂浓度、温度、浸泡时间必须精确控制和记录。
- 中和剂验证是核心： 无效中和会导致假阳性（残留灭菌剂抑制复苏微生物生长），有毒中和剂会导致假阴性。必须在试验前完成严格的验证。
- 生物指示剂质量： 确保使用的染菌载体质量可靠，芽孢数量稳定、抗力符合要求。
- 充分的培养时间： 必须遵循相关标准或方法规定的培养时间，确保受损微生物有足够机会复苏生长。
- 重复性与代表性： 设置足够的重复样本（通常≥3），确保结果可靠。载体应具有代表性（如材质、形状）。
- 环境温度影响： 实验室环境温度需稳定，避免显著波动影响水浴温度精确性。
- 结果局限性： 此试验为定性测试，仅能判断在规定条件下是否达到无菌（杀灭所有试验微生物），不能提供杀灭微生物的数量（D值）或灭菌保证水平（SAL）等定量信息。若需定量数据，应采用载体浸泡定量杀菌试验或悬浮定量杀菌试验。
七、结论
载体浸泡定性灭菌试验是评估液态化学灭菌剂灭菌效力的基础而重要的实验室方法。通过严格控制试验条件、使用标准化的生物指示物、进行充分有效的灭菌剂中和，并设置完备的对照体系，该试验能够可靠地判断灭菌剂在特定参数组合下是否能完全杀灭高抵抗力的微生物芽孢，为实际灭菌应用提供科学依据，对保障医疗器械安全、控制感染传播发挥着不可或缺的作用。严格遵守操作规程和质量控制要点是获得可信赖试验结果的关键。