柯萨奇病毒定量杀灭试验

发布时间：2025-07-01 11:53:36 阅读量：1 作者：生物检测中心

柯萨奇病毒定量杀灭试验方法

一、 引言

柯萨奇病毒（Coxsackievirus），属于小RNA病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus），是引发人类多种疾病的重要病原体，包括手足口病（主要由柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型引起）、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、心肌炎、流行性肌痛等。由于其传播途径多样（粪-口途径、呼吸道飞沫、密切接触等），且在外界环境中具有一定抵抗力，对环境和物品进行有效的消毒对于控制其传播至关重要。定量杀灭试验是评价消毒因子（如物理方法、化学消毒剂）对柯萨奇病毒灭活效果的金标准方法，旨在测定消毒因子在特定条件下使病毒滴度下降的对数值（Log Reduction Value, LRV）。

二、 试验目的

本试验旨在通过规范的实验室程序，定量评估特定消毒因子（如化学消毒剂、物理消毒方法）在设定的作用浓度（或强度）和作用时间下，对悬液内指定型别柯萨奇病毒的灭活效果，计算其杀灭对数值（LRV），为消毒因子的实际应用提供科学依据。

三、 试验原理

  1. 病毒培养与滴定： 使用易感细胞系（通常为RD细胞、Vero细胞或HEp-2细胞）增殖柯萨奇病毒，并通过细胞病变效应（CPE）或其他方法（如TCID50法）测定病毒悬液的初始滴度。
  2. 消毒因子暴露： 将已知滴度的病毒悬液与消毒因子在设定的条件下（浓度/强度、温度、pH、有机干扰物存在与否、作用时间）进行混合作用。
  3. 终止消毒反应： 加入中和剂（或采取稀释、物理去除等方法）及时、有效地终止消毒因子对病毒的持续灭活作用，并验证中和剂对消毒因子的中和效果及对病毒和细胞的无害性（中和剂鉴定试验）。
  4. 残留病毒感染性测定： 将经消毒因子处理并中和后的样本（试验组）、仅消毒因子处理的对照（消毒剂对照）、仅病毒无消毒作用的对照（病毒阳性对照）以及中和剂/细胞毒性对照等，接种到易感细胞培养体系中。
  5. 病毒滴度计算： 通过观察CPE或其他终点判定方法（如空斑法），计算试验组和病毒阳性对照组在作用终点时的病毒滴度（通常以TCID50/mL或PFU/mL表示）。
  6. 杀灭对数值（LRV）计算： LRV = Log10(病毒阳性对照组平均滴度) - Log10(试验组平均滴度)。LRV ≥ 4.00（即病毒滴度下降≥99.99%）通常被认为是消毒有效的指标。
 

四、 材料与试剂

  1. 病毒株： 标准柯萨奇病毒株（推荐使用国际通用株，如Coxsackievirus A16, Coxsackievirus B3等），经实验室传代、鉴定并测定滴度。
  2. 细胞系： 对目标柯萨奇病毒株易感的细胞系，如人横纹肌肉瘤细胞（RD）、非洲绿猴肾细胞（Vero）、人喉癌上皮细胞（HEp-2）。需进行无菌检查及支原体检测。
  3. 细胞培养基： 含适量血清（如胎牛血清，浓度为2-10%）和抗生素（如青霉素、链霉素）的细胞生长培养基（如MEM、DMEM），以及用于病毒稀释和维持的维持培养基（血清浓度通常降至0-2%）。
  4. 消毒因子： 待测的化学消毒剂溶液或待测的物理消毒设备/方法。
  5. 中和剂： 针对待测消毒因子的有效中和剂溶液（如硫代硫酸钠中和含氯消毒剂、甘氨酸中和戊二醛等）。必须预先通过中和剂鉴定试验验证有效性。
  6. 稀释液： 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2-7.4）或其它适宜的维持病毒稳定性的等渗缓冲液。
  7. 有机干扰物质： 按标准要求配制的小牛血清和白陶土悬液（或酵母提取物），用于模拟实际消毒环境中的有机物负载。
  8. 其他： 细胞培养瓶/板、移液器及无菌吸头、无菌试管、恒温水浴箱或特定消毒设备、生物安全柜、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、低温冰箱（-70℃或以下）、液氮罐（如需长期保存病毒种）。
 

五、 试验方法

  1. 试验前准备：

    • 细胞准备： 在试验前24-48小时，将状态良好的易感细胞接种至适宜的细胞培养容器（如96孔板用于TCID50，6孔板用于空斑法），使其在试验当日生长至约80-90%汇合度。
    • 病毒悬液制备： 取保存的标准病毒毒种，经易感细胞增殖后收获含病毒培养液（需出现明显CPE），经冻融、离心（去除细胞碎片）后分装小份，测定滴度（TCID50/mL或PFU/mL）后作为工作病毒液备用。试验用病毒液滴度通常要求在10^5 TCID50/mL或PFU/mL以上。
    • 消毒剂溶液配制： 按待测消毒产品的说明书或试验设计浓度，用无菌硬水（或含特定干扰物的溶液）配制所需浓度的消毒剂溶液。使用前需测定其有效成分浓度是否达标。
    • 中和剂溶液配制： 按已验证的配方配制中和剂溶液。
    • 干扰物溶液配制： 按标准（如GB/T 38502-2020 消毒剂实验室杀菌效果检验方法）要求配制含特定浓度小牛血清和白陶土的有机干扰溶液。

  2. 试验分组：

    • 试验组： 病毒悬液 + 消毒剂溶液 + 有机干扰物（根据试验设计可选）。
    • 消毒剂对照组： 消毒剂溶液 + 有机干扰物（同试验组）+ 中和剂 + 细胞培养基（不含病毒，验证中和剂能否中和消毒剂毒性及消毒剂本身对细胞的毒性）。
    • 病毒阳性对照组： 病毒悬液 + 有机干扰物（同试验组）+ 中和剂 + 稀释液（代替消毒剂，验证试验体系中病毒存活能力）。
    • 细胞毒性/中和剂对照组： 稀释液 + 中和剂 + 有机干扰物（同试验组） + 细胞培养基（不含病毒，验证中和剂和稀释体系对细胞无毒）。
    • 正常细胞对照组： 仅细胞培养基（验证细胞正常生长状态）。
    • (可选) 稀释液对照组： 病毒悬液 + 有机干扰物（同试验组） + 稀释液（代替消毒剂）+ 中和剂（验证稀释液本身对病毒无影响）。

  3. 作用过程：

    • 在预设的温度（如20±1℃）下，将病毒悬液与含有机干扰物的溶液（如果适用）混合均匀。
    • 迅速加入配制好的消毒剂溶液，立即混匀并开始计时。最终反应体系中，病毒悬液的比例通常为1:9（即1份病毒加入9份消毒剂溶液），以达到足够的消毒剂浓度。
    • 在设定的作用时间点（如0.5min, 1min, 2min, 5min, 10min, 30min等），精确吸取反应混合物，立即加入到预设浓度的中和剂溶液中（中和剂体积通常≥9倍取样体积），充分混匀，作用至少10分钟以完全中和消毒剂活性。
    • 对于病毒阳性对照组，同时将病毒悬液加入到相应体积的稀释液（代替消毒剂）中，混匀，并在相同时间点加入相同浓度的中和剂溶液中混合。

  4. 病毒感染性检测（以TCID50法为例）：

    • 将经中和处理的试验组、病毒阳性对照组样本进行一系列10倍梯度稀释（如10^0, 10^-1, 10^-2, ... 10^-8）。
    • 将不同稀释度的病毒液接种至预先准备好的单层细胞培养板孔中（如96孔板，每稀释度至少4-8孔），同时设置细胞阴性对照孔（仅加维持培养基）。
    • 置于37℃, 5% CO2培养箱中培养。
    • 每日在倒置显微镜下观察细胞病变效应（CPE）。柯萨奇病毒通常引起细胞变圆、皱缩、聚集、脱落等典型CPE。
    • 连续观察直至细胞阴性对照孔状态良好，且最高稀释度的阳性对照孔CPE不再变化（通常需5-7天）。记录每个稀释度出现CPE的孔数。

  5. 数据处理与分析：

    • 病毒滴度计算（TCID50/mL）： 采用Reed-Muench法或Spearman-Kärber法等统计学方法，根据各稀释度出现CPE的孔数，计算病毒阳性对照组和各试验组样本在作用终点时的病毒滴度（Log10 TCID50/mL）。
    • 杀灭对数值（LRV）计算：
      • LRV_t = Log10(病毒阳性对照组平均滴度) - Log10(试验组t时间点平均滴度)
      • 计算各组平行试验的LRV及其均值、标准差。
    • 结果判定：
      • 若试验组在设定作用时间点的平均LRV ≥ 4.00（即病毒滴度下降≥99.99%），且所有平行试验的LRV均≥3.00（滴度下降≥99.9%），并且消毒剂对照组、细胞毒性/中和剂对照组均无毒性（细胞生长正常），病毒阳性对照组滴度符合要求（通常Log10滴度≥5.00），则该消毒因子在此试验条件下被判定为对试验柯萨奇病毒株达到有效灭活。
      • 若试验组LRV < 4.00，或任一平行试验LRV < 3.00，或对照组结果不符合要求，则判定为无效或不满足要求。
 

六、 注意事项

  1. 生物安全： 柯萨奇病毒的操作必须在符合生物安全二级（BSL-2）或以上级别要求的实验室中进行。操作人员需穿戴适当的个人防护装备（实验服、手套、必要时佩戴口罩或面罩），严格遵守实验室生物安全规范。所有废弃物需经有效消毒（如高压蒸汽灭菌）后方可丢弃。
  2. 无菌操作： 整个试验过程，特别是涉及细胞培养和病毒操作的步骤，必须在生物安全柜内进行严格的无菌操作，避免微生物污染。
  3. 标准化： 严格按照标准操作规程（SOP）进行，控制试验条件（温度、时间、混合方式、试剂浓度等）的一致性，确保结果的可重复性和可比性。
  4. 中和剂有效性验证： 必须在正式试验前进行严格的中和剂鉴定试验，确保所选中和剂能够完全、及时地中和消毒剂残留活性，且自身对病毒和细胞无毒无害。
  5. 病毒稳定性： 保证病毒悬液在处理过程中（特别是稀释和加入中和剂时）的稳定性，避免非消毒因素导致的滴度下降。
  6. 细胞状态： 使用状态良好、传代次数适中的细胞进行试验，细胞密度应均匀一致。维持培养基中的血清浓度需适当降低以避免干扰病毒吸附。
  7. 对照设置： 必须设置完整的对照组，它们是判断试验结果有效性的关键依据。任何对照组结果异常，试验结果均视为无效。
  8. 重复试验： 为确保结果的可靠性，每种试验条件应至少进行3次独立的重复试验。
  9. 结果解读： 本试验结果为实验室条件下的定量评估，实际应用效果可能受现场环境因素（温度、有机物负载、材质、作用方式等）影响。LRV值仅针对试验所用的特定柯萨奇病毒株。
 

七、 结论

本试验方法详细描述了评估消毒因子对柯萨奇病毒体外杀灭效果的定量试验程序，包括病毒培养、消毒因子暴露、中和、病毒感染性检测及数据分析等关键步骤。通过规范操作和严格的质量控制（如对照组设置、中和剂验证、重复试验），可以获得可靠的LRV值，为评价消毒因子对柯萨奇病毒的灭活效能提供客观、科学的实验室数据支持，对指导相关传染病的防控和消毒实践具有重要意义。