狂犬病毒中和剂鉴定试验：原理、方法与意义
狂犬病是一种几乎100%致死且人兽共患的病毒性疾病。预防狂犬病最有效的策略是在暴露前或暴露后及时接种疫苗，诱导机体产生具有保护作用的中和抗体。准确鉴定和定量血清或其它体液样本中的狂犬病病毒中和抗体（RVNA），对于评估个体免疫状态（如职业高风险人群、旅行者）、评价疫苗免疫原性、监测群体免疫覆盖率以及指导暴露后预防（PEP）方案至关重要。狂犬病毒中和剂鉴定试验正是实现这一目标的标准化实验室核心技术。
一、 核心原理
中和试验的核心在于利用抗体与病毒的特异性结合能力。当中和抗体存在时，它能识别并结合狂犬病病毒表面特定的抗原表位（主要是糖蛋白G），从而：
- 阻止病毒吸附： 阻挡病毒颗粒与宿主细胞表面的受体（如神经细胞粘附分子NCAM、p75神经营养因子受体、烟碱型乙酰胆碱受体等）结合。
- 干扰病毒侵入： 阻止病毒通过膜融合或内吞作用进入宿主细胞。
- 阻断病毒脱壳： 干扰病毒在细胞内的脱壳过程释放其遗传物质。
- 促进病毒清除： 抗体结合后可介导补体依赖的细胞毒作用（CDC）或抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）清除病毒颗粒或被感染的细胞。
这种结合导致病毒丧失感染和能力，即被“中和”。中和试验在体外模拟这一过程：将待测样本（含潜在中和抗体）与已知量的标准狂犬病病毒毒株预先混合孵育，然后将此混合物接种到易感细胞上。如果样本中存在中和抗体，病毒感染细胞的能力将被抑制，后续病毒导致的细胞病变效应（CPE）或病毒抗原表达将减少或不出现。通过检测未被中和的残留病毒感染性，即可定量计算出样本中的中和抗体水平。
二、 主要标准化鉴定方法
国际上广泛认可和使用的标准方法主要有两种：
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快速荧光灶抑制试验 (Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test, RFFIT)
- 原理： 待测血清/样本与固定量的标准狂犬病病毒（通常为CVS-11株）混合孵育。将混合物接种到生长于微孔板内的易感细胞（如小鼠神经母细胞瘤细胞NA或人喉癌上皮细胞HEP-2）单层上。同时设置阳性对照（已知滴度的国际标准血清）、阴性对照（无中和活性血清/稀释液）和病毒对照（仅病毒无血清）。
- 检测终点： 孵育一定时间（通常20-24小时，具体取决于所用细胞系）后，细胞被固定，用荧光素标记的抗狂犬病病毒特异性抗体（通常是针对病毒核蛋白N的抗体）进行染色。
- 结果判读： 在荧光显微镜下观察。未被抗体中和的病毒感染细胞并，形成可被荧光抗体染色的感染灶（荧光灶）。通过比较待测样本孔与病毒对照孔的荧光灶数量，计算样本抑制50%或更多荧光灶形成所需的最高稀释度，即中和抗体滴度。通常表示为国际单位每毫升（IU/mL），通过与标准血清的对比进行校准。
- 优势： 快速（约24-48小时出结果）、相对敏感、标准化程度高，是目前全球应用最广泛的方法。
- 关键步骤注意点：
- 细胞状态必须良好，接种密度一致。
- 病毒滴度需精确测定并在有效期内使用。
- 孵育时间和温度严格控制。
- 荧光抗体染色条件优化，避免非特异性荧光。
- 荧光显微镜判读需经验丰富的技术人员，或采用自动化成像分析系统。
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荧光抗体病毒中和试验 (Fluorescent Antibody Virus Neutralization Test, FAVN)
- 原理： 与RFFIT基本原理相同，均为基于荧光抗体检测感染灶的中和试验。
- 主要区别在于操作细节：
- 孵育时间： FAVN的病毒-抗体混合物与细胞的作用时间通常更长（如48小时或根据所用细胞系优化）。
- 细胞类型： 常用细胞系如幼仓鼠肾细胞BHK-21。
- 标准化细微差异： 在样本稀释方案、病毒用量、结果计算的具体公式和判读标准上可能与RFFIT存在细微差异，但核心原理一致。
- 结果判读与意义： 同RFFIT，计算抑制50%荧光灶形成所需的血清稀释度，换算成IU/mL。
- 应用： FAVN在国际上也被广泛认可，尤其在欧洲等地常用，常用于伴侣动物（犬猫等）免疫状态评估和国际旅行检疫。
三、 标准试验流程概要
尽管RFFIT和FAVN细节有异，标准流程大致遵循以下环节：
- 样本前处理：
- 血清样本采集后需及时分离，避免溶血。
- 通常需要56℃水浴灭活30分钟，以灭活样本中非特异性抑制物（如补体）和潜在污染的生物活性物质，同时保持抗体活性。灭活后立即冰浴冷却。
- 根据预估抗体水平或试验要求，用细胞培养维持液（如含2%胎牛血清或其他适宜添加剂的MEM/DMEM）对样本进行系列梯度稀释（常为2倍或4倍稀释）。
- 病毒准备： 使用标准化的狂犬病病毒工作毒株（如CVS-11），精确测定其感染滴度（通常用50%组织培养感染剂量TCID50/mL或噬斑形成单位PFU/mL表示），并在试验中使用固定量（如100 TCID50）。
- 中和反应： 将等体积的系列稀释血清样本与等体积的含固定量病毒的稀释液混合。同时设立：
- 阴性血清对照： 无中和活性的血清或稀释液 + 病毒。
- 阳性血清对照： 已知滴度的国际标准狂犬病免疫血清 + 病毒。
- 细胞对照： 仅细胞 + 维持液（无病毒无血清）。
- 病毒回归对照： 仅病毒 + 维持液（无血清）。
- 混合物在适宜条件下（如37℃，5% CO2）孵育一定时间（通常60-90分钟），使抗体与病毒充分结合。
- 细胞接种： 将上述病毒-血清混合物（或对照）接种到预先制备好、状态良好的易感细胞单层（铺于96孔板或其它合适器皿）上。
- 孵育培养： 细胞在适宜条件（37℃，5% CO2）下培养一段时间（RFFIT约20-24小时；FAVN通常48小时），让未被中和的病毒感染。
- 检测与染色：
- 细胞固定（常用80%丙酮或其它适宜固定剂）。
- 冲洗去除固定剂。
- 加入荧光素标记的抗狂犬病病毒特异性抗体（通常是抗-N蛋白抗体），孵育。
- 彻底冲洗去除未结合的荧光抗体。
- 结果判读：
- 在荧光显微镜下观察每孔。
- 记录出现特异性荧光（表明病毒感染存在）的细胞数或荧光灶数量。
- 病毒对照： 应显示大量荧光灶（表明病毒活性良好）。
- 阴性血清对照： 荧光灶数量应与病毒对照相近。
- 阳性血清对照： 其滴度应在预期范围内。
- 细胞对照： 应无荧光灶。
- 待测样本： 找到能抑制50%荧光灶形成的样本最高稀释度，即50%终点滴度。
- 滴度计算与标准化：
- 根据Reed-Muench法或Spearman-Kärber法等统计方法计算样本的50%终点滴度（通常表示为1:X，X为稀释度倒数）。
- 通过与同时测试的国际标准阳性血清的滴度进行对比，将样本的终点稀释度（1:X）换算成国际单位每毫升（IU/mL）。例如，如果标准血清滴度为1:X时相当于Y IU/mL，那么待测血清在相同抑制程度下的滴度1:X也相当于Y IU/mL。通过该血清建立的校准曲线，即可将其他样本的终点滴度换算为IU/mL。国际公认的血清保护水平阈值是 ≥ 0.5 IU/mL。
四、 试验质量控制与意义
- 标准化： 严格遵守世界卫生组织（WHO）、世界动物卫生组织（WOAH）或国家相关机构发布的标准化操作规程至关重要。使用国际标准品进行校准是保证结果可比性（不同实验室、不同时间点）的核心。
- 对照设置： 完善的阳性和阴性对照是保证试验有效性的基石。
- 人员培训： 操作人员需经过严格培训，尤其在荧光显微镜判读方面需要经验积累以保证准确性。
- 生物安全： 狂犬病病毒属于高致病性病原体，所有操作必须在符合相应生物安全等级（通常BSL-2或更高，取决于具体毒株和操作）的实验室进行，严格遵守生物安全规范，穿着个人防护装备（PPE），废弃物需严格消毒灭菌处理。
- 应用价值：
- 评估疫苗免疫效果： 判断个体或群体接种疫苗后是否产生足够的保护性抗体。
- 指导暴露后预防： 对于曾接种过疫苗的暴露者，检测中和抗体水平≥0.5 IU/mL，可考虑简化或豁免后续加强接种（需结合伤口情况和疫苗史综合判断）；对于未接种者或抗体不足者，指导及时进行规范的PEP。
- 疫苗研发与质控： 评价候选疫苗的免疫原性；用于疫苗批签发中的效力检验（替代动物保护力试验）。
- 血清流行病学调查： 监测特定人群或动物种群中的免疫水平。
- 出入境检疫： 证明伴侣动物满足目的地国家/地区的狂犬病抗体要求（通常要求抗体≥0.5 IU/mL，并在指定实验室检测）。
五、 总结
狂犬病毒中和剂鉴定试验，特别是标准化的RFFIT和FAVN，是评估针对狂犬病病毒保护性免疫力的金标准方法。它们通过体外定量检测样本（主要是血清）中和狂犬病病毒感染性的能力，以国际单位（IU/mL）报告中和抗体水平。严格遵循标准化操作规程、完善的质量控制措施和高等级的生物安全防护是保证试验结果准确、可靠、可比且安全的关键。其结果为狂犬病的预防、控制和管理（包括疫苗接种效果评价、暴露后处理决策、疫苗研发质控和国际旅行检疫等）提供了不可或缺的科学依据。