带状疱疹病毒中和剂鉴定试验

发布时间：2025-07-01 11:34:27 阅读量：1 作者：生物检测中心

带状疱疹病毒中和剂鉴定试验：原理、方法与意义

摘要： 中和试验是评估针对带状疱疹病毒（Varicella-Zoster Virus, VZV）的抗体或候选药物（统称为“中和剂”）能否有效阻断病毒感染宿主细胞能力的关键方法。本试验为评价疫苗免疫原性、抗病毒药物效力及恢复期血清保护水平提供了直接依据。本文将详细介绍基于细胞培养的VZV中和试验原理、操作流程及结果解读。

一、 引言
带状疱疹病毒（VZV）是一种嗜神经性α疱疹病毒，初次感染引起水痘，潜伏感染再激活则导致带状疱疹。中和抗体是宿主抵抗VZV感染的重要免疫效应因子。鉴定和定量能够中和VZV的试剂（如单克隆抗体、多克隆抗体、小分子抑制剂等）对于疫苗研发、治疗性抗体筛选、抗病毒药物评价及免疫保护相关性研究至关重要。

二、 试验原理
中和试验的核心原理是将待测中和剂（如血清样本、纯化抗体或药物）与一定量的活VZV病毒在体外预先孵育。在此期间，具有中和活性的试剂会与病毒颗粒表面的关键抗原（如gB, gE, gH/gL等糖蛋白）结合，阻止病毒吸附宿主细胞或阻断其进入细胞的过程。随后，将病毒-中和剂混合物接种到易感细胞（通常为人二倍体成纤维细胞，如MRC-5或WI-38细胞）中培养。通过检测残留的病毒感染力（如空斑形成单位 - PFU），即可判断中和剂抑制病毒感染的能力。

三、 关键实验材料

  1. 病毒株： 通常使用经充分鉴定的实验室适应株（如Oka株）或临床分离株。病毒滴度需预先精确测定。
  2. 宿主细胞： 人二倍体成纤维细胞系（如MRC-5, WI-38）。细胞需处于良好状态，通常使用低传代次数的单层细胞。
  3. 待测中和剂：
    • 血清样本（需灭活补体，如56°C 30分钟）
    • 纯化的单克隆或多克隆抗体
    • 候选抗病毒药物（小分子化合物、多肽等）
  4. 对照：
    • 阳性对照： 已知高滴度的抗VZV阳性血清或标准品。
    • 阴性对照： 无抗VZV活性的阴性血清、同型对照抗体或无活性药物载体。
    • 病毒对照组： 仅含病毒的稀释液（无中和剂）。
    • 细胞对照组： 仅含细胞维持液的未感染细胞。
  5. 培养基与试剂： 细胞生长培养基（如MEM+10% FBS），维持培养基（如MEM+2% FBS），覆盖琼脂或甲基纤维素，固定液（如甲醇或甲醛），染色液（如结晶紫、中性红）。
 

四、 实验方法（以空斑减少中和试验为例）

  1. 细胞准备： 将易感细胞接种于培养板（如6孔板或24孔板）中，培养至形成均匀致密单层。
  2. 病毒稀释： 将VZV病毒原液用维持培养基进行系列稀释，选取能产生适宜数量空斑（如30-100 PFU/孔）的稀释度用于正式试验。
  3. 中和反应：
    • 将待测中和剂进行系列倍比稀释（通常在U型96孔板中进行）。
    • 向每个稀释度的中和剂孔中加入等体积的预稀释病毒液（含目标PFU数量）。
    • 设立病毒对照孔（仅病毒液+稀释液）和细胞对照孔（仅稀释液）。
    • 充分混匀，置37°C 5% CO₂培养箱中孵育60-90分钟，使病毒与中和剂充分作用。
  4. 接种与吸附：
    • 吸弃培养板中原有细胞培养基。
    • 将病毒-中和剂混合物（或病毒对照）接种到对应的细胞单层孔中。
    • 置37°C 5% CO₂培养箱中吸附60-90分钟，期间定期轻摇以保证分布均匀。
  5. 覆盖与培养：
    • 吸附结束后，吸弃接种物。
    • 在每孔中加入覆盖培养基（如含有2% FBS的MEM与琼脂糖或甲基纤维素的混合液）。
    • 待覆盖层凝固后，将培养板置37°C 5% CO₂培养箱中培养。VZV空斑形成通常需要5-7天。
  6. 空斑染色与计数：
    • 培养结束后，吸弃覆盖物（或直接固定）。
    • 用固定液固定细胞单层。
    • 用染色液（如结晶紫）染色，使空斑清晰可见（未感染细胞被染色，感染细胞形成的空斑不着色）。
    • 在显微镜或体视镜下计数每孔的空斑数量（PFU）。
 

五、 结果计算与解读

  1. 空斑计数： 记录各试验孔（含不同稀释度中和剂）、病毒对照孔和细胞对照孔的空斑数。
  2. 空斑减少率计算： 计算各中和剂稀释度下的空斑减少率：
    空斑减少率 (%) = [(病毒对照孔平均PFU - 试验孔PFU) / 病毒对照孔平均PFU] × 100%
  3. 中和效价确定：
    • 血清/抗体效价 (NT50/PRNT50)： 通常报告能减少50%空斑数（即空斑减少率≥50%）的最高血清/抗体稀释度的倒数。可通过回归分析（如Probit分析、Spearman-Kärber法）或作图法（Log稀释度 vs. 抑制率%）精确计算。
    • 药物效力 (IC50)： 报告能减少50%空斑数（即空斑减少率≥50%）的药物浓度。同样可通过回归分析计算。
  4. 质量控制：
    • 病毒对照孔PFU应在预期范围内。
    • 阳性对照应达到预期的中和效价或抑制率。
    • 阴性对照不应显示中和活性（PFU与病毒对照相近）。
    • 细胞对照应无空斑形成且细胞形态正常。
 

六、 方法学变体

  • 高通量中和试验： 使用免疫荧光法（IFA）或酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测感染灶，可在更短时间内（如2-3天）获得结果，适用于大规模筛查。
  • 报告基因法： 构建表达荧光素酶或荧光蛋白的VZV重组病毒，通过检测报告基因信号强度量化病毒感染，实现自动化检测。
 

七、 应用与意义

  1. 疫苗评价： 评估接种者血清中抗VZV中和抗体水平，是衡量疫苗免疫原性和保护效果的关键指标。
  2. 治疗性抗体开发： 筛选和鉴定具有高效中和活性的单克隆抗体，评价其体外抗病毒效力。
  3. 抗病毒药物筛选： 评价候选药物阻断VZV感染细胞的能力，确定其体外抗病毒活性（IC50）。
  4. 免疫保护相关性研究： 探索血清中和抗体滴度（NT50）与临床保护效力之间的关联，为建立免疫保护阈值提供依据。
  5. 基础研究： 研究VZV入侵机制、抗体表位及病毒逃逸突变。
 

八、 局限性

  1. 操作复杂耗时： 传统空斑试验周期长（5-7天），操作步骤多。
  2. 技术要求高： 细胞培养、病毒操作及空斑计数需要专业技能，结果可重复性受操作影响。
  3. 细胞依赖性： 结果受所用细胞系状态和敏感性影响。
  4. 体外局限性： 体外结果不能完全模拟体内的复杂免疫环境（如细胞免疫、补体作用等）。
 

九、 结论
VZV中和试验是鉴定和定量评价能有效阻断病毒感染的中和剂（抗体、药物等）的基石方法。尽管存在一定局限性，经过精心设计和标准化的中和试验，特别是空斑减少中和试验（PRNT），因其直接反映病毒生物学活性被中和的效果，在疫苗研发、抗体药物评价、抗病毒药物筛选及免疫学研究领域具有不可替代的重要价值。选择合适的方法（传统PRNT或高通量替代方法）并严格进行质量控制是获得可靠数据的关键。