真菌定量杀灭试验标准操作规程
1. 引言
本试验旨在定量评估消毒剂/抗真菌制剂对目标真菌的杀灭效力。采用悬液定量法，在特定条件下测定样品杀灭微生物的能力，以杀灭对数值（Log Reduction Value, LRV）作为核心评价指标。
2. 材料
2.1 试验菌株：
* 酵母菌：Candida albicans (ATCC 10231)
* 霉菌：Aspergillus brasiliensis (ATCC 16404) 孢子悬液 （注：根据具体测试需求选择一种或多种代表性菌株）
2.2 培养基与试剂：
* 马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 或 沙氏葡萄糖琼脂 (SDA)：用于菌种培养、计数。
* 磷酸盐缓冲液 (PBS, 0.03 mol/L, pH 7.2)：用于菌悬液稀释、样品洗脱。
* 中和剂溶液：
* 组成：需经验证能有效中和待测样品残留活性且对试验微生物无毒害、不影响其复苏生长（如：含特定浓度的卵磷脂、聚山梨酯80、硫代硫酸钠、组氨酸等的组合溶液）。
* 灭菌方式：过滤除菌或高压灭菌（视成分而定）。
* 无菌硬水： 含规定浓度钙镁离子的水（如：342 mg/L CaCl₂·2H₂O），用于稀释样品模拟实际水质条件。
* 待测样品：指需要测试其杀灭真菌效力的消毒剂或抗真菌制剂。使用时需使用无菌硬水或PBS稀释至设定的测试浓度。
2.3 仪器设备：
* 恒温培养箱 (20-25°C 用于霉菌孢子培养复苏；根据菌种要求设定，通常25-30°C用于酵母菌)。
* 恒温水浴箱 (设定试验所需接触温度±1°C)。
* 微量移液器 (10μL, 100μL, 1000μL) 及无菌吸头。
* 漩涡混合器。
* 电磁搅拌器 (用于混匀含霉菌孢子的样品)。
* 菌落计数器或自动菌落计数仪。
* 天平。
* 计时器。
* 无菌培养皿 (90 mm)。
* 无菌试管、离心管。
* 生物安全柜 (操作需在相应等级的生物安全柜内进行)。
3. 方法
3.1 试验前准备：
* 所有玻璃器皿、培养基、稀释液、中和剂均需灭菌。
* 根据待测样品说明书或试验设计，用无菌硬水或PBS配制所需浓度的测试液。
* 中和剂验证试验：必须预先完成，确认所选中和剂能达到中和效果且无毒性。
* 实验室环境：清洁，温度控制在20-25°C。
3.2 菌悬液制备：
* 酵母菌： 取新鲜培养物（24-48h）用PBS洗脱，离心洗涤（3000 rpm, 10 min）去除培养基成分，重悬于PBS中，调节浓度至约1.0×10⁷ - 5.0×10⁷ CFU/mL。
* 霉菌孢子： 取斜面或平板培养7-14天的成熟孢子，用含0.05%聚山梨酯80的无菌PBS洗脱。经灭菌玻璃珠或涡旋震荡充分分散孢子，过滤（如无菌纱布或滤膜）去除菌丝碎片。离心洗涤（3000 rpm, 10 min）后，用含0.05%聚山梨酯80的PBS重悬孢子，调节浓度至约1.0×10⁶ - 5.0×10⁶ CFU/mL。孢子悬液需在4°C保存，并在24小时内使用。
3.3 中和剂毒性及中和效果验证：
* 毒性验证： 将0.5 mL菌悬液加入4.5 mL中和剂溶液中，混匀作用10 min。取0.5 mL此混合液加入4.5 mL PBS中，进行10倍系列稀释，倾注平板计数。同时设阳性对照（菌悬液+PBS）。中和剂组回收率应 ≥ 阳性对照组的80%。
* 中和效果验证：
* A组 (中和产物组)：0.5 mL菌悬液 + 0.5 mL测试样品，作用设定时间(如5min) → 加入4.0 mL中和剂，混匀作用10min → 取样稀释计数。
* B组 (测试样品组)：0.5 mL菌悬液 + 0.5 mL测试样品，作用设定时间 → 加入4.0 mL PBS（代替中和剂），混匀 → 取样稀释计数。B组应无菌生长或菌落极少。
* C组 (中和剂+菌组)：0.5 mL菌悬液 + 4.5 mL中和剂，混匀作用10min → 取样稀释计数（同毒性验证）。
* D组 (PBS+菌组)：0.5 mL菌悬液 + 4.5 mL PBS → 取样稀释计数（阳性对照）。
* 要求：A组回收率 ≥ D组的70%，且 ≥ C组的70%；B组回收率 < A组的0.1%；C组回收率 ≥ D组的80%。
3.4 杀灭试验步骤：
* 将恒温水浴箱预热至设定温度 (如20°C或25°C)。
* 试验组： 取5.0 mL测试液于无菌试管中，置水浴中平衡至设定温度。加入0.1 mL菌悬液，立即涡旋混匀并开始计时。作用至设定时间 (如1 min, 5 min, 10 min, 20 min) 时，立即取出0.5 mL混合液，加入盛有4.5 mL预冷中和剂的试管中（即1:10稀释），立即充分涡旋混匀（试管需预先置于冰浴中效果更佳）。中和作用10 min。
* 阳性对照组： 用无菌硬水或PBS代替测试液，其余步骤同试验组（包括加入中和剂）。通常设作用时间为“0 min”（即菌悬液加入后立即中和）。
* 活菌计数： 对中和后的试验组和阳性对照组样品进行10倍系列稀释（通常稀释至10⁻²或10⁻³）。取适宜稀释度的样品0.1 mL，或采用倾注法（取1.0 mL）接种于PDA或SDA平板上。每个稀释度接种2-3个平板。将平板倒置于适宜温度培养（酵母菌通常2-3天，霉菌孢子通常3-7天）。
* 计数： 选择平板菌落数在30-300 CFU之间的稀释度进行计数。计算该稀释度下每毫升样品的平均活菌数（CFU/mL）。
3.5 结果计算：
* 阳性对照组平均活菌浓度 (N₀)： 计算“0 min”阳性对照组的平均活菌浓度（CFU/mL）。
* 试验组作用后平均活菌浓度 (Nₓ)： 计算各作用时间点试验组的平均活菌浓度（CFU/mL）。
* 杀灭对数值 (Log Reduction Value, LRV)：LRV = lg N₀ - lg Nₓ
* 杀灭率 (Kill Rate, %)：杀灭率 (%) = [(N₀ - Nₓ) / N₀] × 100%
* 结果报告： 报告各作用时间点的平均LRV值和/或平均杀灭率（通常保留一位小数）。注明试验温度、菌株、样品浓度、作用时间等关键参数。
4. 质量控制
- 试验需设置有效的阳性对照组（≥1.0×10⁶ CFU/mL）。
- 中和剂验证试验必须合格。
- 试验重复次数：通常每个作用时间点需设置3个平行样品进行试验，整个试验至少独立重复3次。
- 温度控制：接触温度波动≤±1°C。
- 计时准确。
- 稀释、接种操作规范，避免交叉污染。
- 实验室环境微生物监控符合要求。
5. 安全注意事项
- 所有操作必须在相应生物安全级别的实验室及生物安全柜内进行。
- 操作人员需穿戴个人防护装备（实验服、手套、口罩、护目镜）。
- 严格按照微生物操作规范进行，防止微生物泄漏和人员感染。
- 试验废弃物需经有效灭菌（如高压蒸汽灭菌）后再按医疗废弃物或实验室废弃物规定处理。
6. 结果解释与报告
- 本试验提供在特定实验条件下，待测样品对指定真菌的定量杀灭效果数据。
- 数据的有效性依赖于严格遵循本操作规程和质量控制要求。
- 试验报告应清晰、完整地记录所有试验条件、方法、原始数据、计算结果及结论。
- 结果的生物学意义和应用需结合具体场景和要求进行综合评估（例如：消毒产品注册通常要求达到特定LRV值，如≥4.00 log₁₀）。
7. 备注
- 本方案为基础悬液定量法。对于特定产品（如不易溶于水的膏体、需特殊处理的器械）或特定要求（如有机物干扰试验），需对方法进行相应修改和验证。
- 霉菌孢子试验中，确保孢子充分分散、避免结块对结果准确性至关重要。
- 接触时间、温度、样品浓度、干扰物（如血清、牛血清白蛋白BSA）等因素显著影响结果，设计试验时应予以考虑。如进行有机物干扰试验，需在菌悬液加入前向测试液加入规定浓度的有机干扰物（如3.0 g/L BSA + 3.0 ml/L 小牛血清）。
重要提示：
- 中和剂选择与验证是本试验成功的关键环节，必须严格执行。
- 本方案旨在提供通用框架，具体实施时需结合实际测试目的和相关标准规范进行调整和优化。操作人员应具备相应的微生物学实验技能和安全知识。 （本方案参照国际/国内相关标准框架制定）