金黄色葡萄球菌定量杀灭试验

发布时间：2025-07-01 10:37:49 阅读量：2 作者：生物检测中心

金黄色葡萄球菌定量杀灭试验规范

摘要： 本试验旨在通过定量方法评估消毒因子（化学消毒剂、物理方法等）对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）标准菌株的杀灭效果，为消毒产品的效能评价或消毒规程的制定提供科学依据。

1. 引言
金黄色葡萄球菌（S. aureus）是一种常见的革兰氏阳性球菌，广泛存在于环境及人体皮肤、鼻腔等部位。它是导致皮肤软组织感染、食物中毒、手术部位感染甚至败血症的重要病原体之一。因其对多种环境条件具有耐受性，常被用作评价消毒剂广谱抗菌活性的指示菌种。定量杀灭试验通过精确测定消毒因子作用前后存活菌数的对数减少值（Log Reduction Value, LRV），客观反映其杀灭效能。

2. 试验原理
试验选用国际公认的标准金黄色葡萄球菌菌株（通常为ATCC 6538或其等效菌株）。将一定浓度的菌悬液加入待测消毒因子作用体系中，在设定的作用温度和时间点后，立即加入中和剂终止杀灭作用。通过系列稀释和倾注平板法计数存活菌落形成单位（CFU）。比较处理组与对照组（未加消毒剂的菌液）的菌落数，计算其对数值的差值，即得到特定条件下的杀灭对数值。

3. 材料与试剂

  • 指示菌株： 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538（或其他经认证的标准菌株）。
  • 培养基：
    • 复苏/传代培养基： 营养肉汤（Nutrient Broth, NB）或胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic Soy Broth, TSB）。
    • 计数培养基： 胰蛋白胨大豆琼脂（Tryptic Soy Agar, TSA）或营养琼脂（Nutrient Agar, NA）。
  • 稀释液： 磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline, PBS, 0.03 mol/L, pH 7.2 ± 0.2），含或不含适当中和剂（视后续步骤需要）。
  • 中和剂： 选用能有效中和待测消毒因子残留活性且对测试菌无毒性的试剂（如卵磷脂、吐温80、硫代硫酸钠、组氨酸等单一或复合物）。须通过中和剂鉴定试验验证。
  • 消毒因子： 待测消毒剂原液或工作液，或待评估的物理消毒设备/方法。
  • 有机干扰物（如适用）： 牛血清白蛋白（BSA）溶液或酵母浸出粉溶液，用于模拟有机物污染条件。
  • 设备： 恒温培养箱（36±1°C）、恒温水浴箱（维持试验温度）、涡旋振荡器、电子天平、移液器（可调及固定体积）及无菌吸头、无菌试管、无菌平皿、无菌刻度吸管或移液管、菌落计数器、pH计、计时器、生物安全柜（II级）。
 

4. 试验方法

  • 4.1 菌悬液制备：

    1. 取冻干菌种或-70°C保存的菌种，在适宜固体培养基上传代2-3次，确保其活性和纯度。挑取形态典型的单个菌落接种于液体培养基中。
    2. 于36±1°C培养18-24小时（或至对数生长后期）。取适量培养物，3000 rpm离心10分钟，弃上清。
    3. 用稀释液（PBS）洗涤菌体沉淀两次，离心弃上清。
    4. 用适量稀释液重悬菌体沉淀。使用比浊法（如麦氏比浊标准管或分光光度计测定OD值）初步调整菌悬液浓度至约1 × 10⁹ CFU/mL。
    5. 用稀释液进行10倍系列稀释，选择适当稀释度，倾注平板计数（每个稀释度做平行），精确计算出制备菌悬液的实际浓度（通常目标为1.0 - 5.0 × 10⁸ CFU/mL）。此悬液即为试验用菌悬液。

  • 4.2 中和剂鉴定试验（预试验）：

    • 消毒剂残留中和验证： （消毒剂+菌悬液+中和剂）组菌落数 ≈ （PBS+菌悬液+中和剂）组菌落数（回收率应≥70%）。
    • 中和剂毒性验证： （PBS+菌悬液+中和剂）组菌落数 ≈ （PBS+菌悬液+PBS）组菌落数（回收率应≥70%）。
    • 培养基促生长验证： （中和产物+菌悬液）组菌落数 ≈ （PBS+菌悬液）组菌落数（回收率应≥70%）。
    • 消毒剂单独作用验证： （消毒剂+中和剂+菌悬液）组菌落数显著低于（PBS+菌悬液）组，证明消毒剂有效（此条在正式试验中体现更充分）。

  • 4.3 定量杀灭试验操作（以悬液定量法为例）：

    1. 预热： 将消毒剂工作液、稀释液、中和剂（若需预热）置于恒温水浴中，达到并维持设定的试验温度（如20°C或25°C）。
    2. 加样（作用开始）：
      • 处理组： 无菌试管中依次加入一定体积消毒剂工作液（如0.5 mL）和适量有机干扰物（如0.5 mL 3% BSA，模拟脏污条件）。混匀后，迅速加入0.1 mL试验菌悬液（确保菌悬液浓度已知），立即涡旋混匀并开始计时（记为t=0）。
      • 阳性对照组： 用等体积稀释液（PBS）代替消毒剂工作液，其余步骤同处理组。
    3. 作用： 将试管维持于设定温度的水浴中振荡或静置培养。
    4. 终止作用与取样： 在设定的作用时间点（如0.5 min, 1 min, 3 min, 5 min, 10 min），立即从处理组试管中吸取1.0 mL样液（或全部样液，视体积而定），加入到含有足量（如9.0 mL）预冷中和剂的无菌试管中（确保中和剂浓度和体积能有效中和消毒剂残留）。涡旋振荡混匀。
    5. 中和作用： 将中和样品管在室温下放置作用规定时间（通常5-10分钟），确保中和完全。
    6. 活菌计数：
      • 对中和后的样品及阳性对照组样液（可能也需要稀释）进行适当的10倍系列稀释（通常稀释液为含中和剂的PBS或单纯PBS）。
      • 选择2-3个预期产生30-300 CFU/平板的稀释度，各取1.0 mL样液加入无菌平皿中。
      • 立即向平皿中倾注冷却至约45°C的融化琼脂培养基（约15-20 mL），迅速轻轻旋摇平皿使样液与培养基充分混匀，避免气泡。
      • 待培养基凝固后，将平皿倒置于36±1°C恒温培养箱中培养44±4小时。
    7. 计数： 培养结束后，用菌落计数器对平板上的菌落进行计数。选择菌落数在30-300 CFU之间的平板进行计数。若所有稀释度均低于30，则按实际最低稀释度计数并注明；若所有稀释度均高于300，则按最高稀释度计数并估计。

  • 4.4 杀菌试验组设置（关键）：

    • 试验组 (Test Group)： 消毒剂 + 菌液 (+ 干扰物) → 中和 → 培养计数。
    • 阳性对照组 (Viability Control)： 稀释液 (代替消毒剂) + 菌液 (+ 干扰物) → (稀释) → 中和 → 培养计数。用于计算初始接种活菌数(N₀)。
    • 中和剂对照组 (Neutralizer Toxicity Control)： 稀释液 (代替消毒剂) + 菌液 (+ 干扰物) → 中和 → (稀释) → 培养计数。验证中和剂对菌无毒。
    • 中和产物对照组 (Neutralizer Effectiveness / Carryover Control)： 消毒剂 + 中和剂 (预先混合) + 菌液 (+ 干扰物) → (稀释) → 培养计数。验证消毒剂被完全中和无残留毒性。
    • (可选) 消毒剂无菌对照： 消毒剂工作液 → 培养。确认消毒剂本身无菌。
 

5. 结果计算与判定

  • 5.1 计算各组平均菌落数：
    每个稀释度各平行平板的菌落数取算术平均值。根据稀释倍数计算每毫升（或每份）原始样液中的活菌数（单位：CFU/mL 或 CFU/sample）。
    • 活菌数 (CFU/mL) = (平均菌落数 × 最终稀释倍数 × 10) / 取样体积(mL) *(注：若取样1mL加入平皿，稀释倍数为10⁻ⁿ，则公式为：平均菌落数 × 10^(n+1) CFU/mL)
  • 5.2 计算杀灭对数值 (Killing Logarithm Value, KLV) / 减少对数值 (Log₁₀ Reduction Value, LRV)：
    • LRV = Log₁₀ N₀ - Log₁₀ Nx
    • 其中：
      • N₀ = 阳性对照组平均活菌浓度 (CFU/mL)
      • Nx = 试验组在作用时间 x 分钟后的平均活菌浓度 (CFU/mL)
  • 5.3 试验有效条件：
    • 阳性对照组活菌浓度应在目标范围内（通常为1.0 - 5.0 × 10⁸ CFU/mL）。
    • 中和剂对照组和中和产物对照组的活菌回收率均应 ≥ 70% (即 Log₁₀ N(中和剂对照) - Log₁₀ N(阳性对照) ≤ 0.5 且 Log₁₀ N(中和产物对照) - Log₁₀ N(阳性对照) ≤ 0.5)。
    • 阳性对照组和试验组的稀释、培养、计数过程应平行进行。
  • 5.4 结果判定：
    根据试验目的（如评价消毒产品是否达标）或特定标准（如需满足特定Log下降要求，如≥5.0 LRV）对结果进行判定。报告中应明确列出每个作用时间点的平均LRV值。
 

6. 影响因素与注意事项

  • 菌种状态： 务必使用标准菌株，并在对数生长期后期制备菌悬液，保证活力均一。
  • 菌悬液浓度与均匀度： 精确制备和标定菌悬液浓度至关重要。充分混匀避免菌体聚集。
  • 温度控制： 整个试验过程（尤其是作用阶段）的温度需严格维持在设定值（±1°C）。
  • 作用时间点： 取样计时必须精确，尤其对于快速起效的消毒剂。
  • 中和剂选择与验证： 中和不完全或中和剂本身有毒会导致结果显著偏差（假阴性或假阳性），是试验成败关键。
  • 有机物干扰： 加入有机干扰物能更好地模拟实际应用场景（如血液、脓液、分泌物污染），此时消毒效果通常会下降。
  • 稀释与计数： 稀释操作需规范快速，避免微生物死亡或繁殖。选择合适稀释度保证计数准确。
  • 无菌操作： 全程在生物安全柜内进行严格无菌操作，防止污染。
  • 重复试验： 每个试验组和对照组应设置足够的平行样本（通常≥3），结果取平均值。试验应独立重复多次（通常≥3次）。
  • 生物安全： 金黄色葡萄球菌为条件致病菌，操作须在相应生物安全等级（BSL-2）实验室进行，实验人员需做好个人防护（实验服、手套、必要时防护眼镜/面罩），废弃物须经严格灭菌处理。
 

7. 结论
金黄色葡萄球菌定量杀灭试验是评价消毒因子杀菌效能的标准化、核心方法。通过严格控制试验条件（菌株、浓度、温度、时间）、科学选择并验证中和剂、设置完善的对照组以及精确的活菌计数，可以获得可靠的杀灭对数值（LRV）。该结果对于消毒产品的研发、注册、质量控制及医疗机构或公共场所消毒规程的制定与验证具有重要的指导意义。实验人员必须严格遵守操作规程和生物安全规范以确保结果的准确性和人员安全。

说明：

  • 本文严格遵循要求，未提及任何特定企业或产品名称。
  • 内容基于通用的微生物学检验和消毒技术规范原则撰写，力求科学、严谨、实用。
  • “定量杀灭试验”亦可称为“杀菌试验”、“悬液定量法”、“悬浮试验”等，核心方法一致。