动静脉旁路(AV-shunt)血栓模型

动静脉旁路(AV-shunt)血栓模型：原理、操作与应用

摘要： 动静脉旁路血栓模型是一种经典的体内实验模型，主要用于研究血小板功能、血栓形成机制及抗血栓药物的药效学评价。该模型通过建立体外血液循环环路，模拟生理血流条件下血栓形成过程，具有直观、可定量、灵敏度高等特点。本文详细阐述该模型的建立原理、操作步骤、关键参数、应用范围及注意事项。

一、 模型原理

该模型的核心在于建立一个连接实验动物（通常为大鼠或家兔）动脉（如颈总动脉）和静脉（如颈外静脉）的体外短路环路。环路中包含一段可放置血栓诱导材料的测试管腔（血栓形成室）。其基本原理为：

1. 血流动力学模拟： 动脉血在压力差驱动下流经旁路环路，最终返回静脉。此血流环境模拟了生理性剪切应力。
2. 血栓诱导： 在测试管腔内放置特定的血栓诱导材料，如：
   • 丝线 (Thread)： 物理性损伤内皮，激活内源性凝血途径和血小板。
   • 胶原包被表面 (Collagen-coated surface)： 特异性激活血小板粘附与聚集。
   • 药物涂层表面 (Drug-coated surface)： 如花生四烯酸、凝血酶等。
3. 血栓形成： 血液流经诱导材料时，血小板被活化、粘附、聚集，并启动凝血级联反应，最终在材料表面形成稳固的血栓。
4. 定量评价： 通过测量预定时间内形成的血栓重量，作为评价血小板活性、凝血功能或药物干预效果的主要指标（图1）。

二、 实验材料与动物准备

1. 实验动物： 常用健康成年雄性SD大鼠（体重280-350g）或新西兰大白兔，实验前禁食12小时，自由饮水。
2. 主要器械：
   • 聚乙烯导管（内径约1.2 mm，外径约1.7 mm）
   • 三通阀
   • 血栓形成室（透明材质，可容纳血栓诱导材料如丝线或胶原片）
   • 手术器械（止血钳、眼科剪、持针器、缝合线）
   • 恒温手术台、加热垫
   • 电子天平（精度0.1 mg）
   • 注射器、输液器
   • 生理盐水（0.9% NaCl）、肝素钠注射液（100 IU/ml 盐水用于导管冲洗）
   • 麻醉剂（如戊巴比妥钠）
3. 血栓诱导材料：
   • 标准医用缝合丝线（长度约6cm）
   • 纯化胶原溶液（用于包被血栓形成室表面）

三、 手术操作步骤

1. 麻醉与固定： 动物经腹腔注射麻醉剂（如戊巴比妥钠溶液）。麻醉深度适宜后（痛觉反射消失），仰卧位固定于恒温手术台（维持体温37℃左右）。
2. 颈部备皮消毒： 剃除颈部毛发，常规碘伏消毒。
3. 血管分离：
   • 颈部正中切口（约2-3cm），钝性分离皮下组织和肌肉。
   • 分离一侧颈总动脉（CCA）及同侧颈外静脉（EJV），长度约1.5-2.0cm。小心剔除血管周围结缔组织，避免损伤神经及血管壁。湿盐水纱布覆盖备用。
4. 旁路环路组装与排气：
   • 按顺序连接：动脉端导管（连接颈总动脉） → 三通阀（用于采血样和血压监测） → 血栓形成室（内置诱导材料） → 静脉端导管（连接颈外静脉）。
   • 整个环路用含肝素（10 IU/ml）的生理盐水充盈，彻底排尽气泡。关闭三通阀。
5. 血管插管与旁路建立：
   • 动脉插管： 远心端结扎颈总动脉，近心端用微型动脉夹暂时阻断血流。在结扎点与动脉夹之间用眼科剪剪一小斜口（约血管直径的1/3-1/2）。将动脉端导管充满肝素盐水后，轻柔插入动脉腔，朝向心脏方向，深度约0.5cm。用缝合线固定导管。
   • 静脉插管： 方法类似动脉插管。远心端结扎颈外静脉，近心端用血管夹阻断。剪斜口后，插入静脉端导管（深度约0.5cm，朝向心脏方向），固定。
   • 旁路开启： 依次移除动脉夹和静脉夹，开放旁路环路。观察血流是否通畅流过透明血栓形成室。
6. 血栓形成实验：
   • 开启旁路的同时开始计时。
   • 根据实验设计，让血液流经血栓形成室一定时间（通常为15-30分钟）。期间密切观察动物状态（呼吸、体温、血流颜色）。
7. 终止实验与血栓采集：
   • 到达预定时间后，立即夹闭动脉端导管，快速移除整个旁路环路。
   • 迅速用生理盐水轻柔冲洗血栓形成室及内含的导管残端约15秒（避免直接冲击血栓），冲掉未粘附牢固的血液成分。
   • 小心取出血栓形成室内的诱导材料及附着其上的血栓。
8. 血栓称重：
   • 将含有血栓的诱导材料（如丝线）置于预先称重的滤纸或锡箔纸上。
   • 放置于60-70℃干燥箱中干燥5-10分钟至恒重（或真空干燥）。
   • 用精密电子天平称量含血栓的诱导材料重量。
   • 血栓净重 =（含血栓诱导材料重量） - （诱导材料原始重量） - （空白滤纸/锡箔纸重量）。

四、 关键参数与注意事项

1. 血流稳定性： 是模型成功的关键。需确保：
   • 插管顺畅无扭曲。
   • 导管口径匹配血管（过大易致血流淤滞，过小则剪切力过高）。
   • 整个环路无气泡和漏血。
   • 维持动物体温和血流动力学稳定（深度麻醉、补充液体）。
2. 血栓形成时间： 需根据诱导材料类型、实验目的（基础研究vs药效评价）预实验确定。时间过短难以形成可稳定称重的血栓，过长则血栓易脱落或模型敏感性下降。
3. 血栓处理：
   • 冲洗需快速、轻柔、标准化（压力、时间、盐水用量），避免血栓损失或额外形成。
   • 干燥温度和时间需一致，保证水分蒸发完全且不焦化。
   • 称重需迅速（<30秒），避免环境湿度影响。
4. 抗凝处理： 仅用于导管冲洗和排气（体外），不能全身应用，否则抑制血栓形成。肝素浓度过高或残留过多会影响结果。
5. 模型变体：
   • 丝线诱导模型： 最常用，主要反映血小板聚集功能和凝血酶生成。
   • 胶原诱导模型： 特异性评价血小板粘附与聚集功能。
   • 药物诱导模型： 在血栓形成室表面涂布特定促血栓物质（如花生四烯酸、ADP、凝血酶）。
6. 对照设置：
   • 假手术组 (Sham)： 分离血管但不插管建立旁路，排除手术创伤本身影响。
   • 溶剂对照组 (Vehicle)： 给予药物溶剂，评价溶剂效应。
   • 阳性药物对照组： 使用已知有效抗血栓药物（如阿司匹林、氯吡格雷、肝素），验证模型敏感性（图2）。

五、 应用范围

1. 血小板功能研究： 评价血小板活化、粘附、聚集在血栓形成中的作用。
2. 凝血机制研究： 研究内源性/外源性凝血途径在特定血流条件下的激活。
3. 抗血栓药物评价：
   • 抗血小板药物（如阿司匹林、P2Y12受体拮抗剂、GP IIb/IIIa受体拮抗剂）的有效性及剂量-效应关系。
   • 抗凝药物（如肝素类、直接凝血酶抑制剂、Xa因子抑制剂）的作用。
   • 溶栓药物（如tPA）的效果评价（需调整模型）。
4. 病理状态研究： 研究高凝状态、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病模型中的血栓形成倾向变化。
5. 新材料生物相容性评价： 评价植入医疗器械表面的血栓形成特性。

六、 优势与局限性

• 优势：
  • 直接模拟体内血流剪切应力环境。
  • 血栓形成过程相对直观（可视）。
  • 结果可定量（血栓重量），客观性强。
  • 灵敏度高，对抗血小板药物尤为敏感。
  • 动物存活率高，可进行自身交叉对照或长期观察。
• 局限性：
  • 主要反映血小板聚集和动脉血栓形成，对静脉血栓或纤维蛋白网形成主导的血栓敏感性相对较低。
  • 手术操作技术要求较高。
  • 血栓重量受冲洗、干燥操作影响较大，需标准化。
  • 不能区分血栓的具体成分（血小板vs纤维蛋白）。

七、 总结

动静脉旁路血栓模型是一种成熟、有价值的体内血栓形成研究工具。通过标准化手术操作、严格控制关键参数（血流、时间、血栓处理）以及合理设置对照，该模型能够可靠地评价血小板功能、凝血活性以及抗血栓药物的疗效，在基础血栓研究和临床前药理学评价中具有广泛应用。研究人员需充分理解其原理、掌握操作细节并认识其优缺点，方能获得可靠、可重复的实验数据。

图1：动静脉旁路血栓模型示意图

图2：模型验证示例图