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脂多糖（LPS）经支气管吸入法诱导急性肺损伤（ALI）动物模型建立与应用

摘要：
脂多糖（LPS）经支气管吸入是建立急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）经典动物模型的可靠方法。该模型通过模拟肺部细菌感染引发的炎症级联反应，重现了肺水肿、中性粒细胞浸润、肺泡-毛细血管屏障破坏等ALI核心病理特征。本文详细阐述该模型的制备原理、操作流程、评价指标及注意事项。

一、模型原理

革兰氏阴性菌细胞壁成分LPS是触发ALI的关键病原相关分子模式（PAMP）。通过支气管直接注入LPS：

1. 激活Toll样受体4 (TLR4)：启动下游NF-κB等信号通路。
2. 促炎因子释放：大量肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）等释放。
3. 中性粒细胞募集：趋化因子（如IL-8/CXCL8）介导中性粒细胞向肺组织浸润。
4. 氧化应激与屏障损伤：活性氧（ROS）产生增加，肺血管内皮细胞及肺泡上皮细胞紧密连接破坏，导致通透性肺水肿。
5. 肺泡表面活性物质失活：加重肺不张和呼吸功能障碍。

二、材料准备（通用名称）

1. 实验动物：成年雄性C57BL/6小鼠（8-12周龄，20-25g）或SD/Wistar大鼠（200-250g）。动物许可需经伦理委员会批准。
2. 主要试剂：
   • 脂多糖（LPS）：来源于大肠杆菌血清型（如O55:B5或O111:B4）。
   • 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。
   • 麻醉剂：如氯胺酮/赛拉嗪混合物（小鼠）、戊巴比妥钠（大鼠）。
   • 镇痛剂（如布托啡诺）。
   • 组织固定液：4%多聚甲醛（PFA）。
3. 仪器设备：
   • 小动物麻醉机/诱导盒。
   • 动物恒温垫。
   • 显微喉镜/耳镜（用于直视声门）。
   • 微量注射器（50-100μL）及钝头套管针（22-24G）。
   • 小动物呼吸机（可选，用于辅助呼吸）。
   • 支气管肺泡灌洗（BALF）收集装置。
   • 分光光度计/酶标仪。
   • 石蜡包埋机、切片机、显微镜。

三、建模操作流程（以小鼠为例）

1. 术前准备：
   • 动物禁食4-6小时（自由饮水）。
   • 配置LPS工作液：用无菌PBS溶解LPS，常用浓度为2-5mg/mL（小鼠最终肺内剂量约5-10mg/kg体重）。
   • 准备无菌套管针连接微量注射器。
2. 麻醉与固定：
   • 使用吸入麻醉（如异氟烷）或腹腔注射麻醉剂诱导麻醉。
   • 确认麻醉深度（无角膜反射和痛觉反射），将动物仰卧位固定于操作板，颈部伸展。
3. 气管插管与LPS滴注：
   • 颈部皮肤酒精消毒。
   • 使用显微喉镜或强光源照明，经口直视声门。
   • 将连接微量注射器的钝头套管针轻柔、准确地插入气管内（避免损伤食道）。
   • 关键步骤：缓慢匀速注入LPS溶液（小鼠常用体积30-50μL）。注射后立即将动物直立旋转数秒，促进液体在肺内均匀分布。
   • LPS对照组注射等体积无菌PBS。
4. 术后护理：
   • 立即移除套管针，观察动物恢复自主呼吸。
   • 置于37℃恒温垫上直至完全清醒。
   • 术后按需给予镇痛剂。
   • 自由饮食饮水。
5. 模型观察期：
   • ALI典型病理变化在造模后24-48小时达高峰。常见观察时间点为6h, 12h, 24h, 48h, 72h。
   • 密切监测动物状态（呼吸频率、活动度、毛发状态）。

四、模型评价指标

1. 肺组织湿/干重比（W/D Ratio）：
   • 处死动物后迅速取肺（避免淤血），称湿重（W）。
   • 65℃烘箱干燥48小时至恒重，称干重（D）。
   • 计算W/D比值，反映肺水肿程度（显著高于对照组）。
2. 支气管肺泡灌洗液（BALF）分析：
   • 气管插管灌注无菌冷PBS（小鼠3×0.8mL，回收率>80%）。
   • 总蛋白浓度：BCA法或Bradford法测定，反映肺泡-毛细血管屏障通透性。
   • 炎症细胞计数与分类：细胞计数板计数总细胞，瑞氏-吉姆萨染色分类中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞比例（显著增加的中性粒细胞是特征）。
   • 炎性因子检测：ELISA检测BALF上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、巨噬细胞炎症蛋白-2（MIP-2/CXCL2）等水平（显著升高）。
3. 肺组织病理学检查（H&E染色）：
   • 肺组织4% PFA固定，石蜡包埋切片。
   • 评估标准（可参考Smith或Matute-Bello评分）：
     • 肺泡内中性粒细胞浸润程度。
     • 肺泡间隔增厚/炎症。
     • 肺泡腔内红细胞/纤维素渗出。
     • 透明膜形成。
     • 肺不张程度。
   • 进行半定量病理评分（0-无损伤，1-轻度，2-中度，3-重度，4-极重度；累积计分）。
4. 肺通透性指数测定：
   • 尾静脉注射异硫氰酸荧光素标记的白蛋白（FITC-albumin）。
   • 一定时间后（如30min），收集BALF。
   • 测定BALF和血浆中FITC荧光强度，计算BALF/血浆荧光比值（显著升高）。
5. 血气分析（如条件允许）：
   • 颈动脉/腹主动脉采血，检测PaO2、PaCO2、pH值等（常表现为PaO2显著下降）。

五、模型特点与注意事项

1. 优点：
   • 操作相对简便，技术掌握后可快速建模。
   • 病变特征典型：重现了人ALI/ARDS的关键病理生理改变（炎症、水肿、屏障破坏）。
   • 剂量与时间可控：可通过调整LPS剂量和观察时间点研究不同严重程度和发病机制。
   • 重复性较好：标准化操作下，结果一致性较高。
2. 缺点：
   • 操作技巧要求高：气管插管不当易导致损伤、误入食道或给药不均。
   • 动物个体差异：对LPS敏感性可能存在品系和个体差异。
   • 模型性质：主要模拟感染（尤其是革兰氏阴性菌）启动的急性炎症反应，对其他原因（如胃内容物误吸、创伤）诱发的ALI模拟效果有限。
   • 自限性：LPS引发的炎症在72小时后可能开始消退。
3. 关键注意事项：
   • 麻醉深度：过深抑制呼吸，过浅导致插管困难引发气道损伤。
   • 无菌操作：全程无菌操作，避免继发感染干扰结果。
   • 给药体积与速度：体积过大或注入过快易引起窒息。务必缓慢匀速注射。
   • LPS浓度与活性：不同来源、批次LPS活性有差异，需预实验确定最佳剂量。
   • 动物福利：严格遵守动物伦理，使用有效麻醉和镇痛，避免不必要的痛苦。
   • 对照组设置：必须设置PBS滴注的假手术组（Sham组）作为对照。

六、结论

LPS经支气管吸入法是诱导啮齿类动物ALI的成熟、可靠的实验模型。通过精确控制操作细节（尤其是气管插管和给药），结合全面的病理生理学评估（肺水肿、炎症浸润、屏障功能、病理学评分），该模型能够有效模拟人类ALI/ARDS的核心病理过程，广泛应用于急性肺损伤发病机制研究、新型治疗药物筛选和作用机制探讨等基础与转化医学研究领域。

参考文献（示例）：

1. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., & Martin, T. R. (2008). Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology, 295(3), L379-L399.
2. Mokrá, D. (2020). Acute lung injury - from pathophysiology to treatment. Physiology Research, 69(Suppl 3), S353-S366.
3. Domscheit, H., Hegeman, M. A., Carvalho, N., & Spieth, P. M. (2020). Molecular dynamics of lipopolysaccharide-induced lung injury in rodents. Frontiers in Physiology, 11, 36.

注意： 文中所有步骤、试剂、设备均使用通用科学名称描述，未提及任何特定生产商或品牌。实验具体参数（如LPS剂量、浓度、动物品系、灌洗体积）需研究人员根据自身实验条件和预实验结果进行优化调整。动物实验必须遵循所在地的伦理法规并获得批准。