内毒素诱导葡萄膜炎模型

发布时间：2025-07-01 08:01:52 阅读量：1 作者：生物检测中心

内毒素诱导葡萄膜炎模型的构建与应用

摘要：
内毒素诱导的葡萄膜炎（Endotoxin-Induced Uveitis, EIU）模型是研究葡萄膜炎发病机制、炎症通路及潜在治疗策略的重要工具。该模型通过外周注射细菌脂多糖（LPS）模拟内毒素血症诱发的急性前葡萄膜炎，具有操作简便、重复性好、诱发炎症时间窗可控等特点。本文系统阐述EIU模型的建立方法、病理特征、分子机制及其在基础与转化研究中的应用价值与局限性。

一、 引言
葡萄膜炎是一组累及葡萄膜（虹膜、睫状体、脉络膜）、视网膜、视网膜血管和玻璃体的炎症性疾病，病因复杂，是重要的致盲性眼病。为深入探究其病理生理过程，开发有效的动物模型至关重要。内毒素（LPS）作为革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，是强烈的炎症激活剂。基于LPS构建的EIU模型主要模拟急性前葡萄膜炎，广泛应用于炎症机制解析和药物筛选。

二、 模型构建方法

  1. 实验动物选择：
    • 最常用：各类近交系小鼠（如C57BL/6, BALB/c），大鼠（如Lewis, Wistar）亦常用。
    • 品系差异：不同品系对LPS敏感性不同（如C3H/HeJ小鼠因TLR4突变对LPS耐受），选择时需注意。
    • 年龄体重：通常选用8-12周龄成年鼠，体重稳定。
  2. 脂多糖（LPS）准备：
    • 来源：大肠杆菌（Escherichia coli）来源的LPS最常见（如血清型O55:B5, O111:B4）。
    • 溶解：用无菌无热原生理盐水（或PBS）溶解配制成所需浓度母液。
    • 储存：分装后于-20℃或-80℃避光冻存，避免反复冻融。
  3. 诱导方法：
    • 注射途径：
      • 足垫皮下注射 (SC)： 最常用。注射部位通常为后肢足垫皮下组织。优点：操作简便，炎症反应典型可靠。
      • 腹腔注射 (IP)： 亦常用。操作相对简单，但个体反应变异可能略大于足垫注射。
    • 剂量：
      • 小鼠：常用剂量范围在50 μg/kg 至 500 μg/kg体重之间（例如，100-200 μg/kg是常用有效剂量）。具体剂量需根据LPS来源、动物品系、实验目的（炎症程度需求）进行预实验优化。
      • 大鼠：剂量通常高于小鼠（例如，100-300 μg/kg）。
    • 注射体积： 通常控制在50-200 μL/只鼠，确保准确给药。
    • 诱导时间窗：
      • 炎症通常在注射后4-6小时开始出现。
      • 炎症高峰：常在注射后18-24小时（如24小时为常用观察/取材时间点）。
      • 炎症通常在48-72小时后逐渐消退。
  4. 对照设置： 必须设立对照组（注射等体积无菌无热原生理盐水或PBS）。
 

三、 病理特征与评估指标

  1. 临床表现：
    • 眼前段体征： 结膜充血、睫状充血、角膜水肿、房水闪辉（裂隙灯显微镜下可见）、房水细胞（炎性细胞）、虹膜充血肿胀、瞳孔缩小或形态不规则、前房纤维素性渗出（严重时），甚至前房积脓。
    • 动物行为： 可能出现精神萎靡、活动减少、眼睑闭合、畏光（喜暗）。
  2. 组织病理学改变：
    • 虹膜和睫状体： 显著充血、水肿，大量中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞浸润。
    • 前房： 大量炎性细胞（主要为中性粒细胞）和蛋白质渗出（房水闪辉、细胞的基础）。
    • 后段（相对较轻）： 可出现轻度视网膜血管炎、视盘水肿、脉络膜炎症细胞浸润（尤其在高峰时）。
    • 血-房水屏障（BACB）破坏： 是关键病理基础，导致蛋白质和细胞渗漏进入房水。
  3. 定量与半定量评估方法：
    • 临床评分系统： 根据结膜充血、虹膜充血、前房闪辉、前房细胞等严重程度制定评分标准（通常0-4级），由观察者在裂隙灯显微镜下盲法评估。
    • 房水蛋白浓度测定： 穿刺抽取房水，采用BCA法或Lowry法测定蛋白浓度，直接反映BACB破坏程度。
    • 房水细胞计数： 收集房水，细胞计数仪或血细胞计数板计数炎性细胞数量。
    • 组织学评分： 眼球摘除后固定、石蜡包埋、切片（矢状面或水平面）、H&E染色，显微镜下对虹膜睫状体炎症细胞浸润程度、前房渗出等进行半定量或定量（图像分析软件）评分。
    • 分子生物学指标：
      • 房水/眼组织/血清中炎症因子检测：ELISA或Multiplex法检测TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 (CXCL8), MCP-1 (CCL2)等促炎因子水平。
      • 眼组织基因表达：RT-qPCR检测炎症因子（TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS, COX-2）、趋化因子（MCP-1, MIP-1α）及相关信号通路分子（TLR4, NF-κB亚基）mRNA表达。
      • 免疫组织化学/免疫荧光：检测眼组织中炎症因子、粘附分子（ICAM-1, VCAM-1）、信号通路活化分子（如p-NF-κB p65）等的表达与定位。
    • 眼底成像 (OCT, FA)：在具备条件时，可用于评估后段炎症（如视网膜厚度变化、血管渗漏），但前段炎症是主要特征。
 

四、 发病机制核心通路
EIU的核心机制是LPS激活模式识别受体（主要是Toll样受体4，TLR4）介导的固有免疫级联反应：

  1. LPS识别与TLR4激活： LPS结合蛋白（LBP）将LPS传递给CD14分子，后者将LPS呈递给TLR4/MD-2复合体，触发TLR4二聚化及构象变化。
  2. MyD88依赖信号通路： 活化TLR4主要通过髓样分化因子88（MyD88）依赖途径。MyD88招募IRAKs（白细胞介素-1受体相关激酶）和TRAF6（TNF受体相关因子6），最终激活IKK（IκB激酶）复合物。
  3. NF-κB活化与核转位： IKK磷酸化IκBα（NF-κB抑制蛋白），导致其被泛素化降解。释放的NF-κB（主要为p65/p50异源二聚体）转位入核。
  4. 促炎因子转录： 核内NF-κB结合靶基因启动子区域，启动大量促炎细胞因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）、趋化因子（如MCP-1, IL-8/CXCL8）、粘附分子（ICAM-1, VCAM-1）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶-2（COX-2）等的转录和表达。
  5. 炎症级联放大与细胞募集： 释放的细胞因子（特别是TNF-α, IL-1β）进一步放大炎症信号。趋化因子吸引中性粒细胞、单核/巨噬细胞等炎性细胞从血管渗出，浸润虹膜睫状体组织及前房。
  6. 血-眼屏障破坏： 炎症因子（如TNF-α, VEGF）和活性氧/氮物种（ROS/RNS）作用于血管内皮细胞，上调粘附分子表达，破坏紧密连接，显著增加血管通透性，导致BACB破坏，房水蛋白和细胞成分增加。
  7. TRIF依赖通路： TLR4也可通过TRIF（TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β）依赖途径激活IRF3和晚期NF-κB活化，诱导I型干扰素（如IFN-β）和部分趋化因子表达，在EIU中也扮演一定角色。
 

五、 模型应用价值

  1. 炎症机制研究： 解析葡萄膜炎早期固有免疫应答的核心信号通路（TLR4/NF-κB等）、炎症因子网络、趋化因子作用、白细胞募集机制、血-眼屏障破坏机制。
  2. 药物筛选与评价：
    • 抗炎药物： 评价糖皮质激素（如地塞米松）、非甾体抗炎药（NSAIDs）的疗效和作用机制。
    • 生物制剂： 评价靶向特定炎症因子（如抗TNF-α抗体、IL-1受体拮抗剂）或受体（如抗TLR4抗体）的治疗效果。
    • 新型小分子抑制剂： 筛选针对关键信号节点（如IKKβ, NF-κB, JAK/STAT, p38 MAPK抑制剂）的化合物。
    • 天然产物/中药单体： 评估其抗炎活性及潜在作用靶点。
  3. 基因功能研究： 利用基因敲除（KO）或转基因小鼠，研究特定基因（如TLR4, MyD88, TNF-α, IL-1β, ICAM-1等）在葡萄膜炎发生发展中的作用。
  4. 疾病修饰疗法探索： 研究免疫调节、抗氧化、内皮保护等策略对炎症进程和屏障修复的影响。
 

六、 模型的优势与局限性

  1. 优势：
    • 操作简便快捷： 无需眼内手术注射，诱导方法简单易行。
    • 重复性好： 动物品系、LPS剂量和注射时间标准化后，可产生高度一致的急性炎症反应。
    • 时间窗明确可控： 炎症发生、发展、消退的时间进程相对固定，便于实验设计和取材。
    • 病理特征明确： 主要表现为急性前葡萄膜炎，病理改变（炎症细胞浸润、BACB破坏）清晰可测。
    • 成本相对较低： 所需设备和试剂相对常规。
  2. 局限性：
    • 主要模拟急性前葡萄膜炎： 难以完全模拟慢性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或特定类型的自身免疫性葡萄膜炎（如VKH, Behcet's病）。
    • 缺乏特异性自身免疫成分： 主要由固有免疫驱动，适应性免疫（T/B细胞）的参与相对次要和短暂，不是研究自身免疫性葡萄膜炎的理想模型。
    • 种属和品系差异： 不同动物种属、品系对LPS的反应性存在显著差异（剂量、炎症程度、高峰期）。
    • 诱导炎症的强度和持续时间有限： 为急性、自限性炎症（通常3天内消退），无法模拟慢性持续状态。
    • 全身性反应： LPS注射可引起全身性炎症反应（发热、行为改变），可能对眼局部观察造成混杂影响（需良好对照）。
    • 不完全等同于人类疾病： 人类葡萄膜炎病因极其复杂（感染、自身免疫、特发性），EIU仅是研究急性炎症机制和药物急性效应的有用工具之一。
 

七、 实验注意事项与优化

  1. 严格无菌无热原操作： LPS本身就是热原，所有试剂（盐水、PBS）、器械（注射器、针头、取材工具）及操作过程必须确保无菌、无热原，避免添加额外刺激。
  2. LPS批次与来源： 不同来源、批次的LPS活性可能存在差异，建议固定使用同一厂家和批次的产品，并在更换时进行预实验。
  3. 动物品系与预实验： 明确所用动物品系对LPS的敏感性基线，通过预实验确定最适宜的LPS剂量和最佳的观察/取材时间点。
  4. 环境控制： 保持动物饲养环境稳定（温度、湿度、光照周期），减少应激。
  5. 标准化评估： 临床评分、组织学评分等应由经验丰富的观察者进行，最好采用盲法评估，以减小主观偏差。尽可能使用客观定量指标（如房水蛋白、细胞因子ELISA）。
  6. 取材时间点选择： 根据研究目的选择关键时间点（如高峰期的24小时用于药效评估；多个时间点用于机制动态研究）。
  7. 伦理考量： 动物实验需遵循“3R”原则（减少、优化、替代），获得伦理委员会批准。密切观察动物状态，必要时采取止痛措施或提前人道终点。
 

八、 结论
内毒素诱导的葡萄膜炎（EIU）模型是研究急性前葡萄膜炎发生机制中固有免疫激活、炎症因子风暴、血-眼屏障破坏等关键环节的经典且有效的工具。其简便性、可重复性和可控性使其在解析炎症通路、筛选和评价抗炎药物方面具有不可替代的价值。研究者需深刻理解其模拟的是急性前段炎症这一核心特点，充分认识到其优势与局限性（尤其是缺乏慢性化和自身免疫成分），合理选择该模型服务于特定的科学问题。通过严格的操作规范、优化的实验设计和标准化的评估体系，EIU模型将持续为葡萄膜炎基础研究与新疗法开发提供重要支持。

参考文献： (此处列出关键文献，例如)

  1. Rosenbaum, J. T., McDevitt, H. O., Guss, R. B., & Egbert, P. R. (1980). Endotoxin-induced uveitis in rats as a model for human disease. Nature, 286(5770), 611-613. (经典奠基文献)
  2. Planck, S. R., Dang, T. T., Graves, D., et al. (1992). Retinal pigment epithelial cells produce interleukin-6 in response to interleukin-1. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 33(1), 78-82. (细胞因子机制)
  3. Koizumi, K., Poulaki, V., Doehmen, S., et al. (2003). Contribution of TNF-alpha to leukocyte adhesion, vascular leakage, and apoptotic cell death in endotoxin-induced uveitis in vivo. The American Journal of Pathology, 162(3), 927-936. (TNF-α作用机制)
  4. Behar-Cohen, F., Savoldelli, M., Parel, J. M., et al. (1998). Reduction of corneal edema in endotoxin-induced uveitis after application of L-NAME as nitric oxide synthase inhibitor in rats by iontophoresis. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 39(6), 897-904. (NOS抑制剂研究示例)
  5. Guidelines for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research (由ARVO等组织发布的最新版本). (动物实验伦理与操作指南)
 

插图建议：

  1. 示意图： TLR4介导的NF-κB信号通路激活及促炎因子释放图。
  2. 流程图： EIU模型构建标准操作流程（动物准备、LPS配制、注射、观察、取材）。
  3. 对比图： 正常眼与EIU模型眼在裂隙灯下（显示充血、前房闪辉/细胞）、组织切片H&E染色（显示炎症细胞浸润）的对比示意图。