TGF-betaII诱导的慢性高眼压模型 - 中析研究所生物检测中心

TGF-β2诱导的慢性高眼压模型：原理、建立与应用

摘要：
转化生长因子-β2 (TGF-β2) 在房水流出通路（尤其是小梁网）的病理生理过程中扮演核心角色，其水平升高与原发性开角型青光眼（POAG）的发病机制密切相关。基于此，通过眼内（如前房或玻璃体腔）重复注射外源性活性TGF-β2蛋白，成功建立了一种模拟人类POAG关键特征的慢性高眼压动物模型。该模型稳定可靠，重现性好，为深入研究青光眼性视神经病变的发病机制、评估潜在神经保护策略及降眼压疗法提供了重要的实验平台。

一、引言
慢性、进行性视神经损伤是青光眼致盲的核心病理过程，而病理性眼压升高是其最主要的风险因素。POAG的特征是房水通过小梁网-Schlemm管途径的外流阻力增加，导致眼压持续升高。众多研究发现，在POAG患者的房水和小梁网组织中，TGF-β2的水平显著上调。TGF-β2是一种强效的细胞因子，可通过刺激小梁网细胞产生过量的细胞外基质（如纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白），抑制基质金属蛋白酶的活性，并促进其抑制剂的表达，最终导致小梁网组织重塑、房水流出阻力增加和眼压升高。利用外源性TGF-β2诱发这一病理过程，成为构建慢性高眼压模型的理论基础。

二、模型建立方法 (以啮齿类动物为例)

实验动物：
- 常用物种：大鼠（如Sprague-Dawley, Brown Norway, Wistar）或小鼠（如C57BL/6）。
- 年龄：通常选用成年动物（如大鼠8-12周龄）。
- 饲养：标准环境（12小时明/暗循环，自由饮食饮水）。所有实验操作严格遵守所在机构的动物实验伦理委员会规定。
试剂准备：
- 活性重组TGF-β2蛋白： 使用商品化的、高纯度、具有生物活性的重组TGF-β2蛋白。
- 载体溶液： 常用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或生理盐水（0.9% NaCl）。载体溶液需不含蛋白酶抑制剂，以避免影响TGF-β2活性。
- 工作液配制： 将TGF-β2蛋白溶解于载体溶液中，配制成所需浓度的工作液（常用浓度范围：大鼠50-500 ng/µl）。分装后于-80°C保存，避免反复冻融。注射前在冰上解冻，短暂离心后置于冰上待用。
操作步骤：
- 麻醉： 动物腹腔注射麻醉剂组合（如氯胺酮/赛拉嗪混合液）或气体麻醉（如异氟烷），确保动物深度麻醉、无痛觉。
- 术前准备：
  - 术眼局部滴表面麻醉剂（如丙美卡因）。
  - 散瞳剂（如托吡卡胺）点眼散瞳，便于观察眼底及操作。
  - 聚维酮碘溶液消毒眼周皮肤及结膜囊。
  - 放置开睑器暴露眼球。
- 注射方式 (常用)：
  - 前房注射：
    - 在手术显微镜下，使用显微注射器连接精细玻璃针头（30-33G）或超细规格针头。
    - 角膜缘穿刺（通常选择颞上方象限），针尖斜面朝上，缓慢平行虹膜面刺入前房，避免损伤虹膜和晶状体。
    - 缓慢注入预定体积的TGF-β2溶液（大鼠常用1-2 µl）。
    - 缓慢退针，穿刺口通常可自行闭合。必要时可轻压片刻或使用角膜灼烧器轻微闭合穿刺口。注射后检查前房深度，确保无渗漏。
  - 玻璃体腔注射：
    - 通过巩膜穿刺（通常在角巩膜缘后1mm处）注入。
    - 同样需精细操作，避免损伤晶状体和视网膜。
- 注射方案: 通常采取重复注射策略以维持慢性高眼压状态。初次注射后，根据眼压监测结果，定期（如每周1-2次）进行补充注射（剂量通常低于首次注射或与之相同）。注射频率和周期（通常持续数周）根据实验设计的目标眼压水平和持续时间调整。
- 对照组： 对照组动物接受同等体积、同等频率的载体溶液（PBS或生理盐水）注射。
- 术后护理： 注射后立即局部给予抗生素眼膏（如红霉素或氧氟沙星）预防感染。动物苏醒后放回笼舍观察。
眼压监测：
- 仪器： 使用校准过的回弹式眼压计或压平式眼压计。
- 流程：
  - 测量前动物需适当镇静（气体麻醉或轻度镇静剂）。表面麻醉剂点眼。
  - 每日或定期（如注射前、注射后数小时、每天固定时间）测量双眼眼压。
  - 通常在同一天相近时间段测量，以减小昼夜节律影响。
  - 多次测量取平均值。记录实验眼和对照眼的眼压值。
- 成功标准： 实验眼眼压显著且持续高于对照组眼及自身基线值（通常升高幅度 > 30%，并维持数周），载体注射对照组眼压无明显变化。

三、模型特征与验证

眼压变化：
- 首次前房注射TGF-β2后，眼压通常在24-48小时内开始升高。
- 通过重复注射维持，可诱导出持续数周甚至数月的慢性中度至重度眼压升高。
- 眼压升高程度和持续时间与注射剂量、频率、所用动物品系相关。
房角结构改变：
- 组织病理学检查（光镜、电镜）可观察到小梁网区细胞外基质（ECM）显著沉积（纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原IV等增多）。
- 小梁网细胞形态异常（如体积增大、胞内空泡增多）。
- 房水流出通道结构紊乱、间隙变窄。
- 关键特征：房角保持开放（开角型特征），无周边虹膜前粘连形成。
视神经损伤：
- 长期高眼压最终导致视网膜神经节细胞（RGC）进行性丢失。
- 视网膜神经纤维层（RNFL）变薄。
- 视神经轴突损伤：表现为轴突肿胀、空泡化、退行性变。
- 视神经横切面可见轴突密度降低、胶质细胞增生。
分子生物学验证：
- 检测模型眼小梁网、视网膜组织中TGF-β2下游信号分子（如Smad2/3磷酸化）的表达上调。
- 检测ECM合成相关基因（如COL1A1, COL4A1, FN1）表达增加，ECM降解酶（如MMP2, MMP9）表达下降或其抑制剂（如TIMP1, TIMP2）表达升高。

四、模型的优势与局限性

优势：
1. 机制驱动： 直接靶向POAG的关键致病因子TGF-β2，病理机制清晰。
2. 慢性进程： 产生的眼压升高是慢性、持续性的，更贴近人类POAG的自然病程。
3. 开角特征： 诱导的病变主要在房水流出通道（小梁网），房角保持开放，严格模拟POAG的解剖特征。
4. 神经损伤可重现： 可导致进行性RGC丢失和视神经病变。
5. 可调控性： 通过调整TGF-β2剂量、注射频率和持续时间，可相对灵活地控制眼压升高的水平和持续时间。
6. 适用性广： 可在多种品系大鼠、小鼠上建立，利于利用转基因/基因敲除动物进行机制研究。
局限性：
1. 侵入性操作： 需要多次眼内注射，存在手术操作相关的风险（感染、炎症、前房出血、白内障、晶状体损伤等），可能导致实验变异。
2. 非生理性升高： 眼压升高由外源性高浓度TGF-β2驱动，不完全等同于人类青光眼缓慢进展的内源性病理生理过程。
3. 潜在炎症反应： TGF-β2本身具有一定免疫调节作用，高浓度注射也可能诱发轻度非感染性炎症反应，需与载体注射组仔细对照区分。
4. 个体差异性： 动物对TGF-β2的反应性可能存在个体差异。
5. 成本与工作量： 需要购买重组蛋白，操作技术要求高，需定期注射和频繁监测眼压，耗时耗力。
6. 物种差异： 啮齿类动物与人类的眼解剖结构（如无真正的Schlemm管）和房水动力学存在差异。

五、模型的应用

青光眼发病机制研究：
- 深入研究TGF-β2信号通路（Smad依赖和非依赖途径）在升高眼压和RGC损伤中的具体作用。
- 探讨ECM代谢失衡、小梁网细胞功能障碍、氧化应激、炎症反应等在房水流出阻力增加中的作用。
- 研究高眼压如何导致RGC死亡（轴突运输障碍、神经营养因子剥夺、谷氨酸兴奋性毒性、自噬/凋亡失调等）。
神经保护治疗策略评估：
- 测试保护RGC及其轴突免受高眼压损伤的新型药物（如神经营养因子、抗凋亡药物、抗氧化剂、抗兴奋性毒性药物、免疫调节剂等）。
- 评价基因治疗、干细胞疗法对RGC存活和功能的保护作用。
- 研究物理性神经保护方法（如弱激光治疗）。
降眼压治疗策略评估：
- 测试新型降眼压药物（尤其是针对增加房水流出的药物，如Rho激酶抑制剂、前列腺素类似物等）在该模型中的效能和持续时间。
- 评估新型药物递送系统（如缓释植入剂、纳米载体）的效果。
- 为微创青光眼手术（MIGS）器械的早期概念验证提供模型。
视神经损伤与修复研究：
- 研究轴突损伤后再生抑制的机制。
- 测试促进轴突再生和功能连接的策略（如抑制胶质瘢痕、阻断髓鞘相关抑制因子信号通路、提供生长支持因子）。

六、结论

TGF-β2诱导的慢性高眼压动物模型是研究POAG发病机制和治疗策略的有力工具。该模型通过模拟人类疾病的关键分子途径——TGF-β2信号通路过度活化，成功诱导出房水流出阻力增加、慢性持续性眼压升高以及继发的视网膜神经节细胞丢失和视神经轴突损伤，且保持开角特征。尽管存在操作侵入性、潜在炎症反应等局限性，其机制相关性高、表型可重现等特点，使其在阐明疾病机理、加速新型神经保护和降眼压疗法的临床前转化研究中发挥着不可替代的作用。未来的研究可着眼于优化注射方案以减少副作用、开发更稳定的持续释放系统，并结合先进的影像学和分子生物学技术深入解析病理生理过程。