冠脉结扎诱导慢性心肌缺血性心衰小鼠模型：原理、构建与评估
摘要：
慢性心肌缺血性心力衰竭（心衰）是心血管疾病死亡的主因之一，建立可靠动物模型至关重要。本文详述通过永久性左冠状动脉前降支（LAD）结扎术诱导小鼠慢性心肌缺血性心衰模型的方法，涵盖手术原理、操作流程、术后监护、表型评估及应用价值，为缺血性心衰病理机制及治疗研究提供标准化技术参考。
一、 模型原理与理论基础
心肌梗死（MI）后心室重构是缺血性心衰的核心病理过程。通过手术永久结扎小鼠LAD：
- 急性缺血坏死： 阻断左室前壁及心尖部血液供应，诱发心肌细胞急性坏死。
- 心室重构： 坏死区被纤维瘢痕替代，存活心肌发生代偿性肥厚、扩张。
- 心功能进行性恶化： 最终导致收缩/舒张功能障碍、心输出量降低，模拟慢性心衰临床进程。
二、 材料与方法
(一) 实验动物
- 品系： 成年（8-12周龄）雄性C57BL/6小鼠（广泛使用，心梗后生存率相对较高）。
- 饲养： SPF级环境，自由饮食饮水，12h昼夜循环。
- 分组： 假手术组（Sham，开胸不结扎冠脉）与模型组（LAD Ligation），每组建议≥10只。
(二) 主要器械与试剂
- 手术器械： 小动物呼吸机、体视显微镜、显微手术器械（精细镊、剪、持针器）、加热垫、小动物剃毛器。
- 缝合材料： 7-0或8-0聚丙烯/Prolene不可吸收缝合线（用于冠脉结扎），6-0丝线或尼龙线（肌肉缝合），5-0尼龙线（皮肤缝合）。
- 麻醉与监护： 异氟烷挥发罐及面罩、氧源、心电监护仪（可选）、体温维持装置。
- 镇痛与抗感染： 丁丙诺啡或布托啡诺（术后镇痛）、抗生素（如恩诺沙星）。
- 评估设备： 小动物超声成像系统、组织病理设备（切片机、染色设备）、生化分析设备。
(三) 手术操作流程（关键步骤）
- 术前准备：
- 小鼠称重，异氟烷诱导麻醉（3-4%），气管插管连接呼吸机（潮气量≈0.2ml/10g体重，频率110-130次/分）。
- 异氟烷维持麻醉（1.5-2.5%），监测呼吸及足趾反射。
- 胸部剃毛，碘伏消毒。置于加热垫维持体温（37℃±0.5）。
- 开胸暴露心脏：
- 左侧卧位固定。于左胸第3/4肋间作1-2cm纵行切口。
- 逐层分离肌肉，暴露肋间肌。用显微剪小心剪开第4肋间隙（避免损伤肺）。
- 轻柔推开肺叶，暴露心包及搏动心脏。
- 冠脉结扎：
- 调整体视显微镜放大倍数（≥10×）。
- 用精细镊轻提左心耳，暴露左心室前壁及LAD主干（通常位于左心耳下缘与肺动脉圆锥之间，呈鲜红色）。
- 用带7-0/8-0缝合线的弯针，在LAD发出第一主要分支（通常靠近左心耳根部下方约1-2mm处）远端进针，穿过心肌浅层，小心避开血管及心室腔。
- 牢固打结3-4次，确保血管完全闭塞。成功标志： 结扎点远端心肌立即变苍白、运动减弱。
- 关胸与复苏：
- 迅速用6-0缝线连续缝合肋间肌（避免漏气），逐层缝合胸壁肌肉。
- 用5-0缝线缝合皮肤切口。
- 停止麻醉，断开呼吸机，轻柔挤压胸廓辅助呼吸直至自主呼吸恢复平稳。
- 移除气管插管，将小鼠置于温暖（37℃）、清洁、安静的环境中单笼恢复。
(四) 术后管理与监护
- 镇痛： 术后即刻及此后至少48h给予镇痛药（如皮下注射丁丙诺啡0.05-0.1mg/kg，q8-12h）。
- 保温： 严格维持体温直至完全清醒。
- 监测： 密切观察24-48小时：呼吸、活动、伤口、体重、精神状态。发现异常及时处理。
- 抗生素： 可预防性使用抗生素（如恩诺沙星5mg/kg皮下注射）。
- 日常护理： 提供软食、饮水，保持笼具清洁。
三、 模型评估与验证
(一) 生存率与一般状态
- 记录术后7天、28天生存率（模型组死亡率通常高于假手术组）。
- 模型组常表现为活动减少、毛发粗糙、体重增长缓慢甚至减轻。
(二) 心功能评估（超声心动图 - 金标准）
- 时间点： 术后4周评估慢性心衰表型（早期如24h、1周评估急性心梗）。
- 方法： 清醒或轻度麻醉下进行。常用指标：
- 左室射血分数（LVEF）%： 显著下降（通常<45%）是心衰的核心标志。
- 左室短轴缩短率（LVFS）%： 显著下降。
- 左室舒张末期内径（LVEDd）与收缩末期内径（LVESd）： 显著增大，提示心室扩张。
- 左室前壁厚度（LVAWd/LVAWs）： 早期可能增厚（代偿），后期可变薄。
(三) 组织病理学评估
- 取材： 实验终点处死小鼠，迅速取出心脏。
- 梗死面积测量（大体染色）：
- 心脏横切为4-5片（从心尖到心底）。
- 1%氯化三苯基四氮唑（TTC）染色（37℃，15-20min）。
- 结果： 存活心肌呈红色，梗死区呈苍白色。计算梗死区占左心室面积的百分比。
- 组织学与纤维化评估（显微镜）：
- 石蜡包埋切片，苏木精-伊红（H&E）染色观察心肌结构破坏、炎症细胞浸润。
- 马松三色（Masson Trichrome）或天狼星红（Sirius Red）染色： 定量评估梗死区及非梗死区（间质）胶原沉积与纤维化程度，是心室重构的关键指标。
- 心室壁厚度测量： 评估存活心肌肥厚程度。
(四) 分子标志物（可选）
- 血浆/心肌BNP/NT-proBNP mRNA或蛋白水平升高。
- 心肌组织炎症因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）表达升高。
- 心肌凋亡（TUNEL染色）等。
四、 模型特点与应用价值
(一) 优势
- 病理生理高度相关： 模拟了人类冠心病心肌梗死后心室重构及慢性心衰的核心过程。
- 表型明确且可量化： LVEF显著下降、心室扩张、纤维化是稳定可靠的心衰标志。
- 技术成熟： 已成为缺血性心衰研究的标准化模型。
- 适用性广： 广泛用于心衰病理机制（炎症、纤维化、代谢、神经内分泌激活等）、药物疗效评价（新靶点药物、干细胞治疗等）研究。
(二) 局限性与注意事项
- 手术难度与学习曲线： 显微手术操作精细，需严格训练以减少操作误差和死亡率。
- 死亡率： 术后早期（24-72h）存在一定死亡率，与手术创伤、心律失常、心源性休克有关。熟练操作和良好监护可降低。
- 梗死大小变异性： 结扎位置、小鼠个体差异（冠脉变异）可影响梗死面积和心衰严重程度。
- 品系差异： C57BL/6是常用品系，但其心梗后纤维化相对较弱。其他品系（如FVB）可能纤维化反应更强烈。
- 假手术对照： 必须设立假手术组以排除开胸手术本身的影响。
- 人道终点： 需严格遵守动物福利规定，设定明确人道终点（如严重呼吸困难、不能进食饮水、体重剧降>20%、垂死状态）。
五、 总结
冠脉结扎诱导的慢性心肌缺血性心衰小鼠模型，通过模拟人类心肌梗死后的病理生理进程，为研究缺血性心衰的发生发展机制及探索新型治疗策略提供了强有力的工具。成功构建该模型的关键在于规范化的显微手术操作、精心的术后护理、严格的心功能监测（超声心动图）以及全面的组织病理学评估。尽管存在手术难度和早期死亡率等挑战，该模型因其高度的临床相关性，仍是心血管基础与转化研究领域不可或缺的金标准模型之一。
核心成功要素提示：
- 精确结扎位点（LAD第一分支远端）是控制梗死面积一致性的关键。
- 严格维持体温与呼吸贯穿手术全程，显著降低术中术后风险。
- 充分术后镇痛与监护是保障动物福利和模型稳定性的基石。
- 4周超声心动图评估（显著LVEF下降+心室扩张）是确认慢性心衰表型的核心依据。
- Masson/Sirius Red染色量化纤维化是评估心室重构程度的必备病理指标。
该模型的规范应用，将持续推动缺血性心力衰竭领域的基础机制突破与治疗手段创新。