tBDL诱导的小鼠或大鼠肝纤维化模型

tBDL诱导的小鼠或大鼠肝纤维化模型：原理、方法与特征

摘要：
三重复胆总管结扎（triple bile duct ligation， tBDL）是诱导实验动物（小鼠或大鼠）肝纤维化及肝硬化的经典手术模型。该模型通过物理性阻塞胆总管，模拟人类胆道梗阻性疾病（如原发性硬化性胆管炎、胆道闭锁）的病理进程，导致胆汁淤积、胆管增生、持续炎症反应，最终引发显著的肝纤维化和肝硬化。本文系统阐述tBDL模型的建立原理、手术步骤、模型特征、病理生理机制及其在肝纤维化研究中的应用价值与局限性。

一、引言
肝纤维化是多种慢性肝损伤（病毒性肝炎、酒精性、代谢性、胆汁淤积性等）后的伤口愈合反应失调，以细胞外基质（ECM）过度沉积为特征。研究其发生机制和探寻有效干预策略至关重要。胆汁淤积性肝病引发的肝纤维化具有独特病理特征。tBDL模型通过手术方式人为制造胆道梗阻，高度模拟人类胆汁淤积性肝病的自然病程，为研究该类肝纤维化提供了可控、可重复的平台。相较于单次胆总管结扎（BDL），tBDL通过三重结扎降低了术后早期因结扎线滑脱导致模型失败的风险。

二、模型建立原理
tBDL的核心原理是利用外科手术结扎并离断胆总管（Common Bile Duct），造成肝外胆道完全性机械梗阻：

1. 胆汁排出受阻： 肝脏持续合成的胆汁无法流入肠道，蓄积于肝内胆管系统。
2. 胆管内压升高： 胆汁淤积导致胆管内压力急剧上升。
3. 胆管上皮损伤： 高压和胆汁成分（特别是疏水性胆汁酸）的毒性作用直接损伤胆管上皮细胞。
4. 炎症反应激活： 损伤细胞释放危险信号（DAMPs），招募和激活中性粒细胞、单核/巨噬细胞（Kupffer细胞），释放促炎因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）。
5. 肝星状细胞活化： 炎症微环境、胆管反应性增生释放的促纤维化因子（TGF-β1, PDGF）、胆汁酸及其受体（如TGR5）信号等共同激活肝星状细胞（HSC），使其转化为肌成纤维细胞（MFB）。
6. 纤维化形成： 活化的肌成纤维细胞大量合成并分泌胶原（I型、III型为主）等ECM成分，沉积于门管区及肝窦周围，形成纤维间隔，最终导致肝纤维化、肝结构重塑乃至肝硬化。

三、手术操作步骤 (以小鼠为例，大鼠步骤类似，需调整器械尺寸)
重要前提： 所有手术操作需在严格无菌条件下进行，遵循动物伦理规范，并获相关委员会批准。术中术后提供有效镇痛。

1. 术前准备：

   • 动物选择： 常用8-12周龄雄性C57BL/6小鼠或SD/Wistar大鼠（雄性更常用以避免雌激素潜在保护效应）。适应性饲养至少1周。
   • 麻醉： 吸入麻醉（如异氟烷）或腹腔注射麻醉（如氯胺酮/赛拉嗪合剂）。术区备皮消毒。
   • 器械准备： 无菌手术器械包（精细镊子、剪刀、持针器、缝合针线）、无菌棉签、生理盐水、无菌缝合线（6-0或7-0不可吸收线用于结扎胆管，5-0可吸收线缝合肌层皮肤）。

2. 手术步骤：

   • 切口： 上腹部正中切口或沿腹白线旁切口，长度约1.5-2 cm（小鼠）。轻柔分离皮下组织和肌肉，暴露腹腔。
   • 暴露胆总管： 用湿润的无菌棉签轻柔将肝脏叶（通常是左外侧叶和中叶）向上翻起，暴露肝门部。在肝门部下方、十二指肠起始部前方，可见一条半透明的细管，即胆总管（通常伴随门静脉和肝动脉）。小心将胆总管与周围血管和结缔组织分离约5 mm长度。
   • 三重结扎与离断： 使用6-0或7-0不可吸收缝线，在胆总管游离段上选择相邻的3个点（间距约1-2 mm），依次进行紧密结扎（确保完全阻断管腔）。在第一结扎点和第三结扎点之间（通常在中间结扎点两侧）小心剪断胆总管。确认胆汁无法通过断端。
   • 假手术组 (Sham)： 仅进行开腹、分离胆总管但不结扎离断的操作，作为对照。
   • 关腹： 逐层缝合腹部肌肉层和皮肤切口。术区消毒。

3. 术后护理：

   • 置于温暖、安静的环境中恢复，直至动物完全苏醒。
   • 提供充足的饮水和易于消化的饲料。
   • 严密的术后监护： 至少连续3天监测动物状态（活动、摄食、精神状态、伤口愈合）。提供术后镇痛管理（如布托啡诺或布洛芬饮水）。
   • 根据需要补充生理盐水以防脱水。

四、模型特征与时间进程
tBDL模型诱导的肝纤维化具有鲜明的胆淤性特征和明确的时间依赖性进展：

• 早期 (术后24-72小时)：

  • 血清标志物：胆红素（TBIL, DBIL）、胆汁酸（TBA）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）显著升高；肝脏酶学（ALT, AST）可能轻度升高。
  • 组织学：胆管明显扩张，胆管上皮细胞肿胀/坏死脱落，门管区水肿，中性粒细胞浸润。

• 中期 (术后1-2周)：

  • 血清标志物：胆汁淤积指标持续高水平，ALT/AST可能因继发性肝损伤而升高。
  • 组织学：胆管反应性增生（大量新生的胆管芽），门管区及小叶内炎症细胞（单核/巨噬细胞、淋巴细胞）浸润显著。肝细胞出现气球样变、羽毛状变性、点灶状坏死。HSC开始活化。纤维化启动： 主要在门管区周围出现纤细的胶原纤维沉积（马松三色染色/Masson Trichrome、天狼星红染色/Sirius Red可显示）。

• 晚期 (术后3-4周及以上)：

  • 血清标志物：胆汁淤积指标持续升高，可能出现肝功能减退的相关指标变化（如白蛋白降低）。
  • 组织学：显著纤维化形成： 胶原纤维明显增粗增多，形成桥接纤维间隔（连接门管区-门管区，门管区-中央静脉）。胆管增生依然活跃。肝细胞损伤持续存在，肝小叶结构紊乱。肝硬化形成 (术后≥4周)： 广泛的纤维间隔分割肝实质，形成大小不等的假小叶结构。肝组织结构显著重塑。

五、模型优缺点分析

• 优点：

  1. 高度模拟胆汁淤积性病因： 准确了胆道梗阻引起的胆汁酸毒性、胆管损伤、炎症及后续纤维化级联反应。
  2. 病变进展迅速且可预测： 纤维化在数周内显著形成，时间线明确，便于实验设计。
  3. 病变程度显著： 可诱导出严重的肝纤维化甚至肝硬化。
  4. 可重复性高： 手术操作标准化后，模型成功率和病变程度较为稳定。
  5. 经典可靠： 是研究胆汁淤积性肝纤维化机制和药物干预的金标准模型之一。

• 缺点：

  1. 侵入性手术模型： 手术创伤本身可诱导炎症反应，可能干扰早期病理机制的研究。
  2. 高死亡率： 尤其在术后第一周，动物可能死于胆汁性腹膜炎、胆管破裂、感染或严重肝功能衰竭。熟练的手术技术和精细的术后护理至关重要以减少死亡率。大鼠通常比小鼠耐受性更好。
  3. 非生理性病因： 急性机械性梗阻与人类慢性渐进性胆道疾病（如PSC）的自然病程不完全等同。
  4. 并发症： 感染、出血、肠梗阻等手术相关并发症风险。
  5. 胆盐池改变： 完全阻断胆汁进入肠道，显著改变肠肝循环和肠道菌群，这些因素本身可能影响肝脏病理。

六、质量控制与注意事项

1. 严格无菌操作： 最大限度降低感染风险。
2. 精准解剖与结扎： 避免误扎门静脉或肝动脉（致命）。确保胆总管三重结扎紧密有效。
3. 假手术组设置： 必须设置Sham组以鉴别手术创伤本身的影响。
4. 术后护理与镇痛： 是降低死亡率、符合伦理要求的关键。
5. 动态监测： 密切观察动物状态，及时处理并发症。
6. 终点指标确认： 通过血清生化（TBA, TBIL, ALP, ALT, AST等）和组织病理学（H&E, Masson, Sirius Red染色， α-SMA免疫组化标记活化HSC）综合评价模型成功与否及纤维化程度。推荐使用半定量评分系统（如Ishak, METAVIR, Scheuer评分系统）评估纤维化分期。
7. 动物品系选择： 不同品系小鼠对tBDL敏感性可能存在差异，C57BL/6是常用品系，但纤维化进展可能不如某些品系（如BALB/c）显著。

七、应用价值
tBDL模型广泛应用于：

1. 机制研究： 深入解析胆汁淤积诱导炎症、氧化应激、细胞死亡（凋亡、坏死）及HSC活化的分子信号通路。
2. 药物筛选与评价： 评估潜在抗纤维化药物（如靶向炎症、HSC活化、ECM代谢、胆汁酸信号通路的化合物）在胆汁淤积性病因背景下的疗效。
3. 诊断标志物研究： 发现和验证与胆汁淤积性肝纤维化进展相关的血清或影像学新标志物。
4. 肝纤维化可逆性研究： 在特定时间点解除胆道梗阻（反结扎模型），研究纤维化消退的机制。

八、结论
tBDL诱导的小鼠或大鼠肝纤维化模型是研究胆汁淤积性肝纤维化和肝硬化发病机制、病理特征及治疗干预的核心实验工具。其优势在于能够可靠且相对快速地重现胆道梗阻后的病理生理变化及纤维化进程。然而，该模型的手术创伤、较高死亡率及与人类慢性疾病病程的差异性是其固有局限。研究者需充分理解其原理、熟练掌握手术技术、严格把控实验条件并遵守伦理规范，才能有效利用该模型获得可靠的研究结果，推动对胆汁淤积性肝纤维化这一重要疾病的科学认知和治疗进展。

主要参考文献 (示例性，需根据实际引用更新)：
(此处省略具体文献列表，实际撰写时应引用关于BDL/tBDL模型建立、病理特征、机制研究的经典及最新文献)