高脂结合小剂量STZ诱导的Ⅱ型糖尿病(小鼠)模型

高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素诱导小鼠Ⅱ型糖尿病模型构建方案

一、引言

Ⅱ型糖尿病（T2DM）以胰岛素抵抗伴随进行性β细胞功能缺陷为特征，是威胁全球健康的重大代谢性疾病。为深入探究其发病机制及开发新型疗法，建立稳定可靠、病理特征接近人类的动物模型至关重要。高脂饮食（HFD）联合小剂量链脲佐菌素（STZ）诱导的小鼠模型，通过饮食诱导胰岛素抵抗叠加药物介导的轻度β细胞损伤，成功模拟了人类T2DM的核心病理生理过程，成为广泛应用的经典模型之一。本方案详细阐述该模型的构建步骤及评价标准。

二、模型构建原理

1. 高脂饮食（HFD）阶段：

   • 目的： 诱导胰岛素抵抗、肥胖及轻度高血糖。
   • 机制： 长期摄入高脂肪、高热量饲料导致脂肪堆积（尤其内脏脂肪），诱发慢性低度炎症、脂毒性、内质网应激等，损害胰岛素信号通路（如IRS/PI3K/AKT），使外周组织（肌肉、肝脏、脂肪）对胰岛素的敏感性下降（胰岛素抵抗）。机体代偿性增加胰岛素分泌，初期可维持血糖正常（高胰岛素血症）。

2. 小剂量链脲佐菌素（STZ）阶段：

   • 目的： 选择性、部分破坏胰岛β细胞功能，削弱其代偿能力，诱发持续性高血糖。
   • 机制： STZ是一种葡萄糖胺亚硝基脲，可通过GLUT2葡萄糖转运体（高表达于啮齿类动物β细胞）选择性进入β细胞。在细胞内释放活性自由基（如一氧化氮），引起DNA烷基化损伤，激活PARP通路及氧化应激，最终导致β细胞凋亡和坏死。小剂量应用旨在造成轻度、渐进性的β细胞损伤（约30-60%），模仿人类T2DM中β细胞功能的进行性衰退，而非引起急性、完全的β细胞破坏（如大剂量STZ诱导的T1DM模型）。

三、实验材料

1. 实验动物：

   • 物种品系： C57BL/6J小鼠是最常用且敏感的品系。雄性小鼠因更易诱导胰岛素抵抗和高血糖，为首选。
   • 周龄与体重： 推荐使用6-8周龄青年雄性小鼠，初始体重约18-22g。
   • 饲养环境： SPF级动物房，标准条件（温度22±2°C，湿度50±10%，12/12小时明暗循环）。动物自由饮水。

2. 试剂：

   • 高脂饲料（HFD）： 脂肪供能比通常为45%-60%（如45%脂肪、20%蛋白质、35%碳水化合物；或60%脂肪、20%蛋白质、20%碳水化合物）。
   • 链脲佐菌素（STZ）： 冻干粉，需低温（-20°C或更低）避光干燥保存。注意：STZ具致癌性和诱变性，操作需严格防护！
   • 柠檬酸钠缓冲液（0.1 M, pH 4.2-4.5）： 用于溶解STZ，保持其稳定性。需新鲜配制并预冷（冰浴）。溶解后溶液需避光保存于冰上，并于配制后短时间内（<30分钟）使用完毕。
   • 生理盐水： 用于稀释葡萄糖溶液或腹腔注射对照。
   • 葡萄糖溶液（20% w/v, 或根据实验需求配制）： 用于口服葡萄糖耐量试验（OGTT）或腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）。
   • 麻醉剂： 如异氟烷或适量水合氯醛溶液（用于尾静脉取血或心脏取血麻醉）。
   • 抗凝剂： 如EDTA或肝素（用于血浆/血清分离）。

3. 仪器设备：

   • 精密电子天平（称量体重、试剂）
   • IP注射器（1ml胰岛素注射器，带小号针头如29G-31G）
   • 灌胃针（用于OGTT）
   • 血糖仪及配套试纸
   • 离心机（用于血液处理）
   • 酶标仪、生化分析仪（用于胰岛素、血脂等检测）
   • 冰箱（4°C， -20°C）
   • 冰盒
   • 计时器

四、造模步骤（详细操作流程）

1. 适应性饲养（可选，推荐1周）：

   • 小鼠购入后，置于标准实验环境。
   • 饲喂普通维持饲料。
   • 每日观察动物状态，适应新环境。

2. 高脂饮食诱导期（关键阶段，通常4-12周）：

   • 将小鼠随机分为两组：
     • 模型组 (HFD+STZ Group)： 饲喂高脂饲料 (HFD)。
     • 正常对照组 (Control Group)： 饲喂普通维持饲料（脂肪供能通常约10-12%）。
   • 周期： 4周是最短常用时间（可诱导显著胰岛素抵抗和肥胖）；8-12周更为理想（代谢紊乱更稳定，模型成功率更高）。具体时长需根据研究目的和造模效果评估调整。
   • 监测：
     • 体重监测： 每周称量体重1-2次，记录体重变化曲线。模型组体重应显著高于对照组。
     • 一般状态观察： 每日观察小鼠活动度、精神状态、毛发、饮水、摄食量及排泄情况。

3. 小剂量STZ注射阶段：

   • 时机： 在高脂饮食诱导期末期（如第4、8或12周末）。
   • STZ溶液制备（关键！）：
     • 在通风橱中操作，佩戴手套、口罩、护目镜及实验服。
     • 根据所需浓度和注射体积（通常10 ml/kg体重），精确计算所需STZ量及柠檬酸缓冲液体积。
     • 用预冷的0.1 M柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2-4.5) 溶解STZ粉末。推荐剂量为35-55 mg/kg 体重（常用40 mg/kg）。例如，目标剂量40 mg/kg，配制浓度为4 mg/ml（即400 mg溶解于100 ml缓冲液）。
     • 溶液需避光并在冰浴中保存。
     • 务必现用现配，并在配制后30分钟内完成注射！
   • 注射操作：
     • 小鼠禁食不禁水4-6小时（通常过夜，如晚8点至早8点）。
     • 准确称量每只小鼠体重。
     • 按计算好的体积（10 ml/kg），腹腔注射 (Intraperitoneal Injection, IP) STZ溶液。对照组小鼠注射等体积的柠檬酸缓冲液。
     • 注射周期： 通常采用连续5天每日注射一次（如周一至周五）。也可采用单次注射（剂量可能需略高，如75-100 mg/kg）或间隔注射（如隔日一次，共3次）。连续多次小剂量注射稳定性更高，更易诱导轻度β细胞损伤。
   • 注射后护理：
     • 注射后密切观察小鼠状态数小时，警惕低血糖反应（行动迟缓、颤抖）。如发现严重低血糖，可腹腔注射少量10%葡萄糖溶液。
     • 注射后次日恢复自由饮水进食（模型组继续HFD，对照组继续普通饲料）。
     • 在注射期及注射后数日内，可在饮水中临时添加5-10%蔗糖以预防严重低血糖（尤其在首次注射后）。

4. 注射后观察与模型确认（关键阶段）：

   • 空腹血糖监测：
     • STZ注射完成后第3天起，开始监测空腹血糖。
     • 方法： 小鼠禁食4-6小时（通常过夜），尾尖采血，血糖仪测量血糖值。
     • 频率： 初期（注射后1周内）可隔天或每天测；稳定后可每周测1-2次。
     • 模型成功标准（常用）： 连续两次（间隔≥48小时）空腹血糖 ≥ 11.1 mmol/L (≥ 200 mg/dL)。通常在注射后1-2周内达到此标准。血糖上升是模型成功的首要标志。
   • 口服葡萄糖耐量试验 (OGTT) 或腹腔葡萄糖耐量试验 (IPGTT)：
     • 目的： 评估机体对葡萄糖负荷的处理能力，反映胰岛素敏感性及β细胞功能。（通常在STZ注射后第1-2周，血糖稳定升高后进行）。
     • 方法 (以OGTT为例)：
       • 小鼠禁食4-6小时。
       • 测定空腹血糖（0分钟）。
       • 按体重灌胃给予葡萄糖溶液（常用剂量2 g/kg体重，浓度20% w/v）。
       • 在给予葡萄糖后的特定时间点（通常为15、30、60、90、120分钟）尾尖采血测定血糖。
     • 评价： 绘制血糖-时间曲线，计算曲线下面积（AUC）。模型组血糖峰值更高，下降更缓慢，AUC显著大于对照组，表明糖耐量受损。
   • 空腹胰岛素测定：
     • 目的： 评估胰岛素分泌水平（通常与OGTT同时进行）。
     • 方法： 在禁食后（OGTT的0分钟点），取少量血样分离血浆/血清。采用ELISA或化学发光法测定胰岛素浓度。
     • 评价： 模型组在糖尿病前期（HFD阶段）可能表现为高胰岛素血症（代偿性）；成功诱导糖尿病后，由于β细胞损伤，空腹胰岛素水平可能降低或与对照组相当（失代偿），但相对于其高血糖状态仍是严重不足的（存在胰岛素抵抗）。
   • 胰岛素抵抗指数评估：
     • 稳态模型评估（HOMA-IR）： HOMA-IR = [空腹血糖 (mmol/L) × 空腹胰岛素 (μIU/ml)] / 22.5。模型组HOMA-IR显著高于对照组，提示胰岛素抵抗。
   • 体重与一般状态： 继续监测体重（模型组可能因高血糖多尿体重略有下降，但仍显著高于对照组基础值）。观察多饮、多食、多尿等症状。
   • 血脂谱检测（可选）： 通常在实验终点取血，检测血浆总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL），模型组常显示血脂异常（高TG、高LDL等）。

五、模型特点与评价

• 优点：
  1. 病理特征接近人类T2DM： 同时模拟了胰岛素抵抗和β细胞功能障碍这两个核心缺陷。
  2. 可控性强： 通过调节HFD时长和脂肪比例、STZ剂量和注射次数，可控制疾病严重程度（从轻度糖耐量异常到显著高血糖）。
  3. 成功率较高且相对稳定： 在C57BL/6J小鼠上成功率通常在60-80%以上。高血糖状态可持续较长时间（数月）。
  4. 成本相对较低： 相较于基因工程模型，成本更低廉。
  5. 周期适中： 整个造模周期通常在6-14周。
• 缺点与局限性：
  1. STZ的个体差异性与毒性： STZ对β细胞的损伤程度存在个体差异，可能导致模型组内血糖水平波动较大。STZ本身有一定肾毒性、肝毒性（尤其剂量控制不当时）。
  2. β细胞损伤机制： STZ主要通过直接细胞毒性作用损伤β细胞，与人类T2DM中淀粉样沉积、脂肪毒性、氧化应激等导致的渐进性β细胞功能障碍在机制细节上不完全相同。
  3. 品系依赖性： C57BL/6J最常用，其他品系敏感性可能不同。
  4. 自发缓解： 少数小鼠（尤其年轻小鼠）在造模成功后可能出现一定程度的高血糖自发缓解（可能与残余β细胞代偿增生有关）。
  5. 酮症风险： 极重度高血糖个体有发生酮症酸中毒的风险。

六、实验设计注意事项

1. 动物伦理： 实验方案必须经过动物伦理委员会审批。密切监测动物状态，对达到人道终点（如严重消瘦、无法进食饮水、活动极度受限、严重溃疡或感染、血糖持续极高>33.3 mmol/L并伴随严重症状等）的小鼠应及时实施安乐死。
2. 严格的对照组设置： 必须设立同时期的正常饲料喂养+柠檬酸缓冲液注射的对照组。
3. STZ操作安全： 严格遵守安全操作规程，防止职业暴露。
4. 血糖监测频率： 注射后早期需勤测血糖以确认模型成功及排除低血糖伤亡。
5. 分组随机化： 在开始HFD前进行随机分组，确保组间初始体重无显著差异。
6. 饲料批次： 尽量使用同一批次的高脂饲料和普通饲料，减少批次间差异。
7. 记录详细： 详尽记录所有操作步骤、动物体重、血糖值、试剂批号、注射时间等原始数据。

七、总结

高脂饮食联合小剂量多次STZ腹腔注射是构建小鼠Ⅱ型糖尿病模型的经典方法。该模型有效模拟了疾病的核心特征——胰岛素抵抗和β细胞功能缺陷。通过严格控制HFD诱导期、STZ剂量与注射方案，并采用空腹血糖、糖耐量、胰岛素水平等多指标进行验证，可以获得成功率较高、病理生理特征符合T2DM的研究模型。在应用该模型时，务必关注动物福利、实验操作的规范性与安全性，并充分考虑模型的优缺点以合理解读实验结果。

提示： 具体实验参数（如HFD脂肪比例、HFD时长、STZ单次剂量、注射次数）需根据具体研究目的、实验室条件和预实验结果进行优化调整。本方案提供的是一个通用且经过验证的框架。