T细胞移植诱导小鼠肠炎

T细胞移植诱导小鼠肠炎模型：原理与应用

摘要
通过过继转移特定T细胞亚群诱导的小鼠肠炎模型，是研究炎症性肠病（IBD）发病机制、免疫调节及治疗策略的核心工具。该模型模拟了人类IBD中T细胞介导的肠道炎症反应，具有高度可控性和可重复性。本文将系统阐述该模型的建立原理、操作流程、表型特征及应用价值。

一、 引言
炎症性肠病（IBD）如克罗恩病和溃疡性结肠炎，以慢性、复发性肠道炎症为特征，T淋巴细胞异常活化在其中扮演关键角色。为深入探究其免疫病理机制并开发新疗法，研究者建立了多种动物模型。其中，过继转移纯化的T细胞亚群（特别是CD4⁺ T细胞）至免疫缺陷受体小鼠体内诱导肠炎的方法，因其能精确控制致病原并重现关键免疫特征，已成为IBD研究的重要平台。

二、 模型建立原理
该模型的核心原理基于以下发现：

1. 致炎T细胞亚群的存在： 在正常小鼠脾脏和淋巴结中，CD4⁺ T细胞可依据CD45RB表达水平分为CD45RBʰⁱ（高表达）和CD45RBˡᵒ（低表达）两个亚群。
2. 免疫调节失衡： CD45RBʰⁱ CD4⁺ T细胞主要包含初始T细胞和效应T细胞前体，具有强致炎潜能；而CD45RBˡᵒ CD4⁺ T细胞富含记忆T细胞和调节性T细胞（Treg），具有抑制炎症的作用。两者在健康个体中保持平衡。
3. 重建免疫缺陷宿主： 将富含CD45RBʰⁱ CD4⁺ T细胞的群体过继转移给缺乏功能性T细胞和B细胞的免疫缺陷受体小鼠（如RAG1⁻/⁻、RAG2⁻/⁻或SCID小鼠）后，由于缺乏Treg的抑制，这些细胞异常活化并攻击肠道共生菌群或自身抗原，最终导致严重肠炎。

三、 实验材料与方法

1. 供体与受体小鼠：
   • 供体： 健康同品系小鼠（常用BALB/c、C57BL/6）。
   • 受体： 免疫缺陷小鼠（如RAG1⁻/⁻、RAG2⁻/⁻或SCID小鼠），通常使用6-8周龄雄性小鼠。
2. 主要试剂与仪器：
   • 细胞分离缓冲液（如PBS+2% FBS）
   • 红细胞裂解液
   • 抗CD4、抗CD45RB抗体（荧光标记或生物素标记）
   • 磁珠分选系统或流式细胞分选仪
   • 细胞培养液（如RPMI 1640 + 10% FBS）
   • 细胞计数仪
   • 注射器（1ml）及针头（27-30G）
   • 麻醉设备（如异氟烷吸入装置）
3. 操作流程：
   • 供体细胞制备：
     1. 无菌条件下取供体小鼠脾脏和淋巴结（肠系膜、腹股沟、腋窝）。
     2. 制备单细胞悬液，通过尼龙毛柱或磁珠负选法初步富集T细胞（可选）。
     3. 使用荧光标记或生物素标记的抗CD4和抗CD45RB抗体染色细胞。
     4. 关键步骤： 利用磁珠分选系统（如基于生物素-链霉亲和素原理）或流式细胞分选仪（FACS），精确分选出CD4⁺ CD45RBʰⁱ细胞。分选纯度应>90%。
     5. 洗涤分选后的细胞，用细胞培养液重悬。
   • 受体小鼠准备与移植：
     1. 受体小鼠适应环境至少1周。
     2. 通过尾静脉注射或腹腔注射途径，将分选好的CD4⁺ CD45RBʰⁱ T细胞（通常剂量范围在3×10⁵ 至 6×10⁵ 个细胞/只小鼠）注入受体小鼠体内。注射体积控制在100-200μl。
     3. 对照组可注射等量PBS或CD4⁺ CD45RBˡᵒ细胞（通常不致病或仅引起轻微炎症）。
4. 术后监测：
   • 体重： 每周测量2-3次体重，体重下降超过初始体重15-20%通常预示严重疾病。
   • 临床症状： 每日观察小鼠活动度、毛发状态、腹泻（肛门污浊）、便血、肛周红肿、弓背等。
   • 疾病活动指数（DAI）： 结合体重变化、粪便性状（硬度、有无血便）、活动状态进行综合评分。
   • 组织病理学评估（终点）：
     • 通常在移植后4-8周（或根据体重下降/临床症状达到预定终点时）处死小鼠。
     • 无菌采集结肠、回肠等肠段，部分用于后续分析（如细胞因子检测、菌群分析），部分固定于10%中性福尔马林。
     • 石蜡包埋、切片、HE染色。
     • 病理学评分标准： 评估指标包括：
       • 炎症细胞浸润深度和密度（粘膜层、粘膜下层、肌层、浆膜层）。
       • 隐窝结构破坏（隐窝变形、分支、萎缩、消失）。
       • 杯状细胞缺失。
       • 溃疡形成。
       • 粘膜/肠壁增厚程度。
       • 每项指标按严重程度分级（如0-3分），计算总分。
   • 其他分析（可选）：
     • 流式细胞术： 分析肠系膜淋巴结、脾脏、固有层淋巴细胞中免疫细胞亚群（如Th1, Th17, Treg）的比例及活化状态。
     • 细胞因子检测： ELISA或CBA法检测血清、结肠组织匀浆或培养上清中促炎因子（如IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-17A, IL-23）及抗炎因子（如IL-10, TGF-β）水平。
     • 实时荧光定量PCR (qPCR)： 检测结肠组织中炎症相关基因（如上述细胞因子、趋化因子、抗菌肽）的mRNA表达。
     • 微生物组分析： 16S rRNA测序分析肠道菌群组成变化。

四、 模型特征与优势

1. 高度可控性： 致病源明确（CD45RBʰⁱ CD4⁺ T细胞），移植时间和剂量可控。
2. 可重复性强： 操作流程标准化后，可在不同实验室稳定诱导出肠炎。
3. 重现关键病理特征： 模型小鼠表现出与人IBD相似的病理改变，包括体重减轻、腹泻、血便、结肠缩短、弥漫性炎细胞浸润（单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）、隐窝结构破坏、杯状细胞减少、溃疡形成等。
4. T细胞依赖性： 直接证明特定T细胞亚群在驱动肠道炎症中的核心作用。
5. 免疫调节机制研究平台： 该模型是研究Treg功能、免疫耐受机制及靶向T细胞疗法的理想工具（如可共移植CD45RBˡᵒ T细胞或Treg以验证其保护作用）。
6. 菌群-免疫互作研究： 明确证实肠道共生菌群是驱动该模型肠炎的必要因素（在无菌条件下移植不会发病），是研究宿主-微生物相互作用的经典模型。

五、 应用领域

1. IBD发病机制研究： 深入解析T细胞异常活化、迁移、细胞因子网络失调、肠道屏障破坏、菌群失调等在肠炎发生发展中的作用。
2. 免疫调节通路验证： 评估特定免疫分子（如细胞因子、趋化因子、共刺激分子、转录因子）在肠炎中的作用（常结合基因敲除小鼠）。
3. 新型治疗策略评估：
   • 药物治疗： 测试抗炎药、免疫抑制剂、生物制剂（如抗细胞因子抗体、抗整合素抗体）的疗效和机制。
   • 细胞治疗： 评估调节性T细胞（Treg）、间充质干细胞（MSC）等过继性细胞疗法的效果。
   • 微生物干预： 测试益生菌、益生元、菌群移植（FMT）、抗菌肽等的治疗潜力。
   • 营养干预： 研究特定饮食成分（如短链脂肪酸、色氨酸代谢物）对肠炎的调节作用。
4. 诊断生物标志物探索： 寻找与疾病活动度相关的血清或粪便标志物。

六、 局限性

1. 急性/亚急性模型： 诱导的肠炎通常进展迅速，与人类IBD的慢性反复特性不完全一致。
2. 依赖于免疫缺陷宿主： 受体小鼠缺乏完整的免疫系统，可能影响对涉及B细胞或其他免疫细胞通路的全面评估。
3. 技术门槛与成本： 细胞分选（尤其是FACS）需要特殊设备和技术，成本相对较高。
4. 供体变异性： 供体小鼠的年龄、品系、饲养环境（菌群）可能影响CD45RBʰⁱ细胞的致病性。

七、 结论
T细胞移植诱导的小鼠肠炎模型是IBD研究领域不可或缺的工具。其核心价值在于精确模拟了T细胞驱动的肠道炎症过程，为深入理解IBD免疫病理机制、验证治疗靶点及评估新型干预策略提供了强有力的实验平台。研究者需充分了解其原理、操作细节、表型特征及局限性，以合理设计实验并准确解读结果，推动IBD研究的不断深入，最终为患者带来更有效的诊疗方案。

八、 伦理声明
所有动物实验操作必须严格遵守所在国家或地区的实验动物福利伦理法规，并获得相关动物实验伦理委员会的批准。实验设计应遵循“3R原则”（替代Replacement、减少Reduction、优化Refinement），尽可能减轻动物的痛苦和不适。