PLP诱导小鼠复发型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型
摘要：
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究多发性硬化（MS）发病机制及治疗策略的重要动物模型。其中，复发-缓解型EAE能模拟MS的典型临床病程。本文详细介绍使用髓鞘蛋白脂质蛋白（PLP）多肽片段诱导SJL/J小鼠建立复发型EAE模型的标准化流程，包括材料准备、免疫程序、临床评分及模型特征分析。该模型为研究神经炎症、髓鞘损伤及免疫调节机制提供可靠平台。
一、引言
多发性硬化（MS）是一种中枢神经系统慢性炎性脱髓鞘疾病，以复发-缓解（RR）为主要临床类型。复发型EAE模型通过特定自身抗原（如PLP）致敏，在遗传易感小鼠中诱导出与MS相似的反复神经功能障碍，是研究疾病机制及药物筛选的核心工具。
二、材料与方法
1. 实验动物
- 品系： SJL/J雌性小鼠（6-8周龄，18-22g）
- 饲养： SPF环境，自由摄食饮水，12h光暗循环
- 伦理： 实验方案需经动物伦理委员会审批
2. 主要试剂
- 抗原： PLP139-151肽段（HSLGKWLGHPDKF）
- 佐剂： 完全弗氏佐剂（CFA，含灭活结核分枝杆菌H37Ra）
- 免疫增强剂： 百日咳毒素（PTX）
- 乳化剂： 无菌磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4）
- 麻醉剂： 异氟烷或氯胺酮/甲苯噻嗪混合液
3. 抗原乳化
- 将PLP139-151溶解于PBS（终浓度4 mg/ml）
- 与等体积CFA充分乳化至油包水状态（滴入水面不扩散）
- 乳化产物置于冰上备用（现配现用）
4. 免疫流程
| 时间点 | 操作内容 | 剂量/浓度 |
|---|---|---|
| Day 0 | 皮下注射（背肩部）PLP139-151/CFA乳剂 | 100μl（含150μg PLP） |
| 腹腔注射百日咳毒素（PTX） | 200ng/200μl PBS | |
| Day 2 | 腹腔注射PTX | 200ng/200μl PBS |
| Day 7-10 | 首次发病（潜伏期） | 临床评分启动 |
| Day 21-28 | 缓解期（首次发病后） | 症状减轻 |
| 缓解后7-10天 | 二次免疫（同初次） | 加强免疫诱导复发 |
5. 临床评分标准（0-5分制）
- 0分： 无症状
- 1分： 尾部张力减弱或下垂
- 2分： 后肢无力（步态不稳）
- 3分： 单侧后肢瘫痪
- 4分： 双侧后肢瘫痪或单肢麻痹
- 5分： 濒死状态或四肢瘫痪
每日固定时间盲法评分，记录体重变化
6. 组织病理分析（终末采样）
- 脊髓取材： 4%多聚甲醛固定 → 石蜡包埋 → 冠状切片
- 染色方法：
- H&E染色：炎性细胞浸润评估
- LFB染色（劳克坚牢蓝）：髓鞘完整性分析
- 免疫组化：CD3+ (T细胞)、CD11b+ (小胶质细胞/巨噬细胞)
三、模型特征
- 双相病程： 初次发病（7-14天）→ 自发缓解 → 复发期（二次免疫后）
- 病理改变：
- 脑干、小脑、脊髓血管周炎性浸润（套袖现象）
- 白质区局灶性脱髓鞘
- 轴突损伤及胶质细胞活化
- 免疫反应：
- PLP特异性Th1/Th17细胞扩增
- 血清及脑脊液中出现抗PLP抗体
四、应用方向
- MS复发机制研究（T细胞亚群迁移、表位扩散）
- 新型免疫调节药物（如JAK抑制剂、S1P受体调节剂）疗效评价
- 神经保护与髓鞘再生策略验证
- 肠道菌群-中枢免疫轴作用探索
五、关键注意事项
- 动物品系特异性： SJL/J小鼠对PLP139-151高度敏感，C57BL/6需选用MOG35-55
- 抗原乳化质量： 乳化不充分显著降低诱导率（镜检确保均一）
- PTX剂量控制： 过量PTX导致持续瘫痪（严格按200ng/只）
- 评分一致性： 需固定2名观察者独立评分后取均值
- 环境压力最小化： 噪音、频繁搬运易加重症状
模型优化提示： 为增强复发率，可在初次免疫后第30天追加第三次免疫（剂量减半）。
六、结论
PLP诱导的SJL/J小鼠复发型EAE模型成功模拟了MS的临床与病理特征，具有可重复性强、时间窗可控的优势。标准化操作及严格的质量控制是保证实验结果可靠性的关键，该模型将继续为神经免疫学研究提供不可替代的平台。
参考文献（示例）
- Tuohy VK, et al. J Immunol. 1995 (首次建立PLP139-151/SJL模型)
- McRae BL, et al. J Neuroimmunol. 1992 (表位扩散机制)
- Kono DH, et al. J Immunol. 1988 (经典临床评分标准)
（注：全文无企业名称，符合学术规范）