HDM/OVA诱导的小鼠AD

HDM/OVA诱导的小鼠特应性皮炎模型：原理与应用

特应性皮炎（AD）是一种常见的慢性、复发性、炎症性皮肤病，以剧烈瘙痒、皮肤干燥和湿疹样皮损为特征，严重影响患者生活质量。为深入研究其发病机制并开发新型疗法，建立可靠且病理特征接近人类疾病的动物模型至关重要。屋尘螨（HDM）和卵清蛋白（OVA）联合诱导的小鼠模型因其能模拟人类AD的关键免疫和病理特征，已被广泛采用。

一、 模型建立原理

该模型的核心在于利用HDM和OVA作为外源性抗原，模拟人类AD患者中常见的环境致敏原暴露：

1. 致敏阶段： 通过皮下注射HDM提取物（包含Der p 1、Der f 1等主要变应原蛋白）和OVA的混合物，联合弗氏不完全佐剂（IFA），打破免疫耐受，诱导强烈的Th2型免疫反应。
2. 激发阶段： 在致敏基础上，将HDM提取物和OVA的混合溶液反复涂抹于小鼠背部或耳部表皮（通常剃毛或胶带剥离处理以轻微破坏皮肤屏障）。这种反复表皮暴露模拟了人类AD患者皮肤持续接触变应原的过程，导致局部炎症反应放大和慢性化。
3. 免疫病理特征模拟： HDM蛋白酶活性可直接损伤皮肤角质形成细胞，破坏皮肤屏障功能；OVA作为模型抗原，进一步增强Th2反应。两者协同作用，有效模拟了人类AD的免疫学核心特征：Th2优势（IL-4, IL-5, IL-13, IL-31升高）、Th22激活（IL-22升高）、Th17参与（IL-17A升高）、IgE水平显著升高以及嗜酸性粒细胞、肥大细胞、2型固有淋巴细胞（ILC2s）的浸润。

二、 实验材料与方法

• 实验动物： 通常选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠或C57BL/6小鼠。BALB/c因其Th2偏向性常为首选。饲养于SPF环境。
• 主要试剂：
  • HDM提取物： 冻干粉，使用前用无菌PBS或生理盐水重悬至所需浓度（范围常在1-100 μg/只/次）。
  • 卵清蛋白（OVA）： 纯度≥98%。
  • 弗氏不完全佐剂（IFA）。
  • 磷酸盐缓冲液（PBS）。
• 建模步骤（示例）：
  1. 致敏（第0、7天）：
     • 将HDM提取物（如25μg）和OVA（如100μg）充分乳化于IFA中。
     • 在小鼠背部皮下多点注射上述乳化混合物（总体积约100-200μL）。
  2. 激发（第14天开始）：
     • 实验前1天，对小鼠背部进行剃毛（或使用温和的脱毛膏），必要时可用胶带轻轻剥离数次以轻微损伤皮肤屏障（模拟AD患者屏障缺陷）。
     • 将HDM提取物（如5-50μg）溶解于适量无菌PBS中，加入OVA（如10-100μg），混合均匀。
     • 使用移液器吸取一定体积（如50-100μL）的HDM/OVA混合溶液，小心涂抹于小鼠剃毛/处理过的背部皮肤表面。
     • 激发频率通常为每周2-3次，持续2-4周或更长时间以诱导慢性炎症（具体频率和时长根据研究目标调整）。
• 对照组设置： 阴性对照组仅接受等量PBS涂抹；单独HDM组；单独OVA组（视具体研究问题而定）。
• 模型监测：
  • 瘙痒行为： 记录抓挠次数（通常需录像分析）。
  • 皮肤病变严重程度评分： 采用改良的人类AD评分标准（如SCORAD的鼠类简化版），评估红斑、水肿/丘疹、表皮脱落/结痂、苔藓化/干燥的程度（0-3分）。
  • 表皮厚度测量： 使用游标卡尺测量激发部位皮肤褶皱厚度。
  • 组织样本收集： 实验结束收集皮损处皮肤组织：部分固定于福尔马林用于石蜡包埋和H&E染色；部分速冻于液氮或-80°C用于RNA和蛋白提取；部分制备单细胞悬液用于流式细胞术分析。
  • 血清收集： 用于检测总IgE和变应原特异性IgE水平（常用ELISA法）。

三、 模型特征与评估

1. 临床表现：
   • 激发部位出现明显的红斑、水肿、表皮脱落和结痂。
   • 显著增加的抓挠行为。
   • 皮肤增厚（慢性期可见苔藓样变）。
2. 组织病理学（H&E染色）：
   • 表皮变化： 显著增厚（棘层肥厚）、角化过度、角化不全、不同程度的海绵水肿。
   • 真皮变化： 血管扩张、水肿，大量炎症细胞浸润，包括淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞和中性粒细胞（程度因模型阶段和位置而异）。
   • 真皮胶原沉积增加： 慢性期可能出现。
3. 免疫学特征：
   • 血清学： 总IgE和HDM/OVA特异性IgE水平显著升高。
   • 细胞因子谱： 皮损局部和引流淋巴结中，Th2型细胞因子（IL-4, IL-5, IL-13, IL-31）、Th22型（IL-22）显著升高；慢性期可能伴有Th1（IFN-γ）和Th17（IL-17A）细胞因子的升高。
   • 炎症细胞浸润： 流式细胞术和组织免疫组化/免疫荧光显示CD4+ T细胞（特别是Th2、Th22亚群）、嗜酸性粒细胞（主要碱性蛋白MBP染色）、肥大细胞（甲苯胺蓝或类胰蛋白酶染色）、活化ILC2s显著增加。
4. 皮肤屏障功能： 经表皮水分流失（TEWL）值通常升高，反映屏障功能受损。

四、 模型的优势与应用

• 优势：
  • 病理特征高度模拟： 能同时再现人类AD的免疫学核心（Th2/Th22偏倚、IgE升高、嗜酸性粒细胞浸润）、临床特征（瘙痒、湿疹样皮损）、组织学特征（表皮增生、炎症浸润）和屏障功能障碍。
  • 可控性强： 抗原种类、剂量、致敏和激发频率、持续时间均可精确控制，便于研究特定因素对疾病的影响。
  • 可重复性好： 操作流程标准化后可获得稳定的表型。
  • 适用于机制研究和药物评价： 是研究AD发病机制（如Th2极化、瘙痒信号通路、屏障修复）、筛选抗炎、止痒、修复屏障的新型治疗药物/方法的理想平台。
• 应用：
  • 阐明AD发病的免疫学机制（如特定细胞因子、趋化因子、信号通路的作用）。
  • 研究皮肤屏障功能在AD发生发展中的作用及其修复机制。
  • 探索瘙痒的发生机制（如IL-31、感觉神经作用）和评估止痒药物疗效。
  • 筛选和评价新型治疗策略（包括小分子药物、生物制剂、单抗、天然产物、局部外用制剂、靶向纳米载体等）的有效性和安全性。

五、 注意事项与局限性

• 动物品系差异： BALB/c与C57BL/6小鼠在免疫应答强度、细胞因子谱等方面存在差异。
• 致敏原和方案差异： HDM来源、批次、浓度、OVA比例、佐剂使用、激发频率、屏障破坏程度的不同会导致模型表现存在差异。需在研究中明确描述关键参数。
• 模型局限性： 人类AD具有显著的遗传背景（如丝聚蛋白基因突变）和复杂的微生物组影响，该模型无法完全模拟这些内在因素。人类AD的自发性特征也难以在小鼠模型中完美。
• 伦理学要求： 动物实验必须遵循严格的伦理学规范并获得伦理委员会批准。应采取措施（如环境富集、疼痛管理）最大限度减少动物痛苦。

结论

HDM/OVA联合诱导的小鼠特应性皮炎模型是一种成熟且广泛应用的实验工具，能够有效模拟人类AD的关键病理生理特征，包括Th2/Th22型免疫反应优势、IgE升高、嗜酸性粒细胞浸润、剧烈瘙痒、表皮增生和屏障功能障碍。该模型具有可控性强、可重复性好、病理特征全面的优点，为深入探索AD的发病机制、病理生理过程和开发新型靶向治疗策略提供了强有力的支撑。研究人员需根据具体科学问题仔细优化实验方案，并理解该模型的内在局限性。