植物花色苷含量检测

发布时间：2025-06-27 18:43:14 阅读量：5 作者：生物检测中心

植物花色苷含量检测方法详解

花色苷是赋予植物花瓣、果实、叶片等呈现红、紫、蓝等鲜艳色彩的重要水溶性色素，属于类黄酮化合物。它们不仅影响植物的观赏价值和经济价值，更具有显著的抗氧化、抗炎、抗癌等多种生理活性。准确测定植物组织中的花色苷含量，对于植物生理生化研究、果实品质评价、功能食品开发以及天然色素利用等领域至关重要。本文将详细介绍一种基于光谱学的常用检测方法——pH示差法。

一、 检测原理 (pH示差法)

pH示差法是目前应用最广泛的花色苷定量方法之一。其原理基于花色苷独特的化学性质：

  1. 花色苷的结构特性： 花色苷分子的发色团（吡喃环）在不同pH环境下结构会发生变化。
  2. pH依赖性： 在强酸性条件下（通常pH 1.0），花色苷主要以红色的黄烊阳离子形式存在，此时其在可见光区域的吸收光谱具有最大吸收波长（通常在510-530nm附近）。
  3. 对比缓冲液： 在中等pH条件下（通常pH 4.5），绝大部分花色苷转变为无色的甲醇假碱形式或浅色的查耳酮形式，在510-530nm处的吸光度显著降低。
  4. 差值计算： 通过测量同一样品溶液在pH 1.0缓冲液和pH 4.5缓冲液中的吸光度差值，可以消除样品中其他非花色苷类色素（如叶绿素降解产物、多酚氧化产物）以及浑浊物在510-530nm处的背景吸收干扰。吸光度差值与花色苷浓度呈线性正比关系。
 

二、 所需试剂与材料

  • 提取溶剂： 酸性甲醇或酸性乙醇溶液（例如：含1%盐酸的甲醇或乙醇溶液）。注意：避光操作，现配现用或短期冷藏保存。
  • 缓冲液：
    • pH 1.0 缓冲液（0.025 M KCl）： 准确称取一定量氯化钾（KCl），用超纯水溶解，用浓盐酸调节pH至1.00 ± 0.01，定容。
    • pH 4.5 缓冲液（0.4 M CH₃COONa）： 准确称取一定量无水乙酸钠（CH₃COONa），用超纯水溶解，用冰醋酸调节pH至4.50 ± 0.01，定容。
  • 超纯水： （电阻率 ≥ 18.2 MΩ·cm）
  • 仪器设备：
    • 分析天平（精度0.0001 g）
    • 研钵（或组织研磨仪）
    • 离心机（转速≥ 10, 000 rpm）
    • 超声波清洗器（或恒温水浴振荡器）
    • 旋涡混合器
    • 移液器（不同量程）
    • 容量瓶（不同规格）
    • 离心管（具塞，避光）
    • 紫外-可见分光光度计
    • pH计（精度0.01）
    • 一次性注射器滤器（0.22 μm或0.45 μm有机系滤膜）或高速冷冻离心机（用于样品过滤/澄清）
 

三、 样品前处理（提取）

  1. 取样与干燥（可选）： 选取新鲜、均匀的植物组织（如花瓣、果皮、叶片），迅速清洗（如需）、擦干表面水分。若样品含水量高或不便于立即处理，可进行冷冻干燥或低温烘干（≤ 40°C），然后粉碎过筛（如40-60目）。记录鲜重或干重。
  2. 粉碎： 称取适量（通常0.1-1.0 g）新鲜样品（或相应质量的干燥粉末）于研钵中，加入少量液氮迅速研磨成细粉；或使用组织研磨仪在低温下粉碎。
  3. 萃取： 将粉末转移至避光的具塞离心管中。加入预冷的酸性提取溶剂（如15-20 mL 1% HCl-甲醇溶液），体积需覆盖样品。
  4. 振荡提取： 剧烈涡旋混合后，置于超声波清洗器中超声提取（功率适中，15-30分钟，冰浴防止过热）或放入恒温水浴振荡器中振荡提取（温度≤ 30°C，时间1-2小时，避光）。超声或振荡过程有助于破碎细胞壁，提高提取效率。
  5. 离心分离： 将提取液在4°C（或室温）下，以10, 000 - 15, 000 rpm离心10-15分钟。
  6. 收集上清： 小心吸取上清液至另一避光的容器中（避免吸入沉淀）。
  7. 洗涤（可选）： 可向沉淀中再加入少量提取溶剂重复提取1-2次，合并所有上清液。
  8. 定容与过滤： 将合并的上清液用提取溶剂定容至一定体积（如25 mL或50 mL）。使用0.22 μm/0.45 μm有机系滤膜过滤，或再次高速冷冻离心（>13, 000 rpm, 10 min）以获得澄清透明的提取液（即花色苷粗提液）。此溶液应低温避光保存，尽快测定。
 

四、 检测步骤

  1. 样品稀释（如需）： 根据初步测试或预估浓度，用酸性提取溶剂将花色苷粗提液适当稀释，使稀释后的溶液在pH 1.0缓冲体系中测得的吸光度在0.2-0.8之间（该范围为光度计线性较好的区间）。
  2. 等分稀释： 准确吸取**两份等体积（V，如1.0 mL）**稀释后的花色苷提取液（或澄清粗提液），分别置于两个干燥洁净的试管或容量瓶中。
  3. 缓冲液定容：
    • 试管A：加入pH 1.0缓冲液（通常体积约为V的4-9倍，如9.0 mL），使总体积为10 mL（即稀释10倍）。充分混匀。
    • 试管B：加入pH 4.5缓冲液（体积同A，如9.0 mL），使总体积为10 mL（即稀释10倍）。充分混匀。
  4. 平衡： 将两支试管室温避光静置平衡15-30分钟，确保花色苷结构转变完全。
  5. 空白对照： 分别用等体积的酸性提取溶剂代替花色苷提取液，按步骤2-4操作两份，分别用pH 1.0缓冲液和pH 4.5缓冲液定容至相同体积（如10 mL），作为相应的空白对照（Blank A 和 Blank B）。
  6. 测定吸光度：
    • 设定分光光度计波长：510 nm（或根据待测花色苷主要成分的最大吸收波长调整，如530nm用于某些葡萄花色苷）。
    • 以超纯水或相应缓冲液作为光度计基线校正。
    • 分别测定：
      • 溶液A在510 nm处相对于Blank A的吸光度值（A<sub>pH1.0</sub>）。
      • 溶液B在510 nm处相对于Blank B的吸光度值（A<sub>pH4.5</sub>）。
    • 注意： 必要时，在700 nm处测定浊度校正值（A<sub>700nm pH1.0</sub> 和 A<sub>700nm pH4.5</sub>）。
 

五、 结果计算

  1. 吸光度差值计算 (ΔA):
    • 简单差值法（适用于溶液澄清度高，浊度影响小）：
      ΔA = (A<sub>pH1.0</sub> - A<sub>pH4.5</sub>)
    • 浊度校正法（更精确，推荐用于澄清度稍差或有浑浊可能的样品）：
      ΔA = (A<sub>510nm pH1.0</sub> - A<sub>700nm pH1.0</sub>) - (A<sub>510nm pH4.5</sub> - A<sub>700nm pH4.5</sub>)
  2. 花色苷含量计算: 花色苷含量常用花青素-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-glucoside, C3G）当量表示，计算公式如下：
    花色苷含量 (mg C3G当量 / 100g 样品) = [ (ΔA × MW × DF × V_total) / (ε × l × W) ] × 100
    • ΔA： 步骤1计算得到的吸光度差值。
    • MW： 矢车菊素-3-葡萄糖苷（C3G）的分子量（449.2 g/mol）。
    • DF： 总稀释因子（包含提取后的定容稀释以及检测步骤中的缓冲液稀释）。
      • 例如：提取液定容至50 mL (DF1=50)，检测时取1 mL提取液用9 mL缓冲液稀释至10 mL (DF2=10)，则总稀释因子 DF = DF1 × DF2 = 50 × 10 = 500。
    • V_total： 花色苷粗提液的最终定容体积（单位：L，即 mL / 1000）。如上例中为 0.050 L。
    • ε： 矢车菊素-3-葡萄糖苷在特定条件下的摩尔消光系数（单位为 L/(mol·cm)）。在pH 1.0，510 nm波长下，广泛接受的值为 26, 900 L/(mol·cm) (Fuleki & Francis, 1968)，或 29, 600 L/(mol·cm) (Giusti & Wrolstad, 2001)。报告中必须注明所使用的ε值。本文示例计算采用26, 900 L/(mol·cm)。
    • l： 比色皿的光程长度（单位：cm），通常为1 cm。
    • W： 用于提取的样品重量（单位：g）。若是鲜样则为鲜重；若是干样则为干重。
    • 100： 换算为每100克样品含量的系数。
 

示例计算：

  • 假设称取鲜样W = 5.00 g
  • 提取后定容至V_total = 0.050 L (50 mL)
  • 检测时取1 mL提取液（DF1=50），用9 mL pH1.0/pH4.5缓冲液稀释至10 mL (DF2=10)，故总DF = 50 × 10 = 500
  • 测得 ΔA = 0.350 (经浊度校正)
  • ε = 26, 900 L/(mol·cm)
  • l = 1 cm
 

花色苷含量 = [ (0.350 × 449.2 × 500 × 0.050) / (26, 900 × 1 × 5.00) ] × 100
计算结果 ≈ 163.5 mg C3G当量 / 100g 鲜重

六、 注意事项

  1. 避光操作： 花色苷对光敏感，整个实验过程（取样、提取、稀释、保存、测定）应尽可能在避光或弱光条件下进行，使用棕色玻璃器皿或铝箔包裹。
  2. 低温环境： 高温会加速花色苷降解，提取和样品处理过程应在低温（冰浴或4°C环境下）进行。
  3. 酸化环境： 提取溶剂必须保持足够的酸性（通常pH<3），以稳定花色苷的黄烊阳离子形态。提取和稀释过程中注意酸性保持一致。
  4. 及时测定： 提取液中的花色苷稳定性有限，应尽快完成测定。如需保存，应置于-20°C或更低温度下避光冷冻。
  5. 缓冲液准确性： pH 1.0 和 pH 4.5 缓冲液的pH值必须精确配制和校准，这是pH示差法准确性的关键。
  6. 摩尔消光系数选择： 不同来源或不同标准品测定的ε值可能略有差异。在报告结果时必须明确说明所使用的ε值及其参考文献来源。使用矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G)当量是较为通用的做法。
  7. 样品代表性： 确保取样的植物组织具有代表性，混合均匀。粉碎要足够细，以提高提取效率。
  8. 背景干扰评估： pH示差法能有效消除大部分干扰，但对于某些特殊基质（如含有高浓度其他色素或干扰物），可能需要结合色谱法（如HPLC）进行准确定性和定量验证。
  9. 仪器校正： 确保分光光度计波长和吸光度读数准确，定期进行校验。
 

七、 总结

pH示差法是一种操作相对简便、成本较低、应用广泛的花色苷定量检测方法。其核心在于利用花色苷在不同pH值下光谱特性的显著差异，通过计算吸光度差值来消除干扰，实现对花色苷总量的测定。严格遵守操作规程（特别是避光、低温、精确pH控制）并准确计算稀释因子和选用合适的摩尔消光系数，是获得可靠结果的关键。本方法适用于大多数植物材料和食品中花色苷总量的测定，为相关研究和应用提供了重要的分析工具。对于成分复杂的样品或需要了解具体花色苷单体组成的情况，建议结合高效液相色谱法（HPLC）或液相色谱-质谱联用法（LC-MS）进行更深入的分析。

注释：

  • 文中提到的摩尔消光系数值（26, 900 L/(mol·cm)）来源于经典文献 Fuleki, T., & Francis, F. J. (1968). Journal of Food Science, 33(1), 72-77。另一种常用值29, 600 L/(mol·cm)来源于 Giusti, M. M., & Wrolstad, R. E. (2001). Current Protocols in Food Analytical Chemistry, Unit F1.2.1-F1.2.13。实际应用时应根据实验室标准或参考最新权威文献选择并注明。