全基因组甲基化测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing, WGBS）是目前研究DNA甲基化最全面、最精确的技术手段之一。DNA甲基化是表观遗传学中最重要的修饰形式，主要发生在胞嘧啶（C）的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC），在基因表达调控、细胞分化、基因组稳定性和疾病发生（如癌症、神经退行性疾病等）中发挥关键作用。传统的甲基化检测方法如甲基化特异性PCR（MSP）或甲基化芯片（Infinium MethylationEPIC BeadChip）仅能覆盖基因组中特定区域，而WGBS则能够实现对全基因组范围内单个胞嘧啶甲基化状态的单碱基分辨率检测，覆盖率达90%以上。随着高通量测序技术的发展和成本的降低，WGBS已成为表观基因组学研究的核心工具，广泛应用于基础科研、临床诊断和药物开发等领域。
检测项目
全基因组甲基化测序主要检测的是基因组中CpG位点以及其他非CpG区域（如CHG、CHH，其中H代表A、T或C）的甲基化水平。检测项目包括但不限于：启动子区域甲基化状态、CpG岛甲基化、基因体甲基化、增强子区域甲基化、印记控制区（ICR）甲基化以及重复序列的甲基化水平。此外，WGBS还可用于识别差异甲基化区域（Differentially Methylated Regions, DMRs），进而分析其在不同组织、发育阶段或疾病状态下的变化规律。这些检测项目对于揭示甲基化在细胞命运决定、肿瘤发生机制及环境因素影响中的作用至关重要。
检测仪器
全基因组甲基化测序依赖于高通量二代测序（NGS）平台，常用的检测仪器包括Illumina公司的NovaSeq 6000、HiSeq X Ten、MiSeq和NextSeq系列等。这些平台具有高通量、高准确性和长读长的特点，能够满足WGBS对大规模数据产出的需求。其中，NovaSeq 6000因其超高通量（单次运行可产出数TB数据）成为大型研究项目的首选。此外，样本制备过程中还需使用DNA提取仪（如QIAGEN QIAcube）、微量分光光度计（如NanoDrop或Qubit荧光定量仪）、片段分析仪（如Agilent Bioanalyzer）以及自动化文库构建系统（如Beckman Biomek FX或Hamilton STAR）等辅助设备，以确保文库质量和实验重复性。
检测方法
WGBS的核心技术流程包括DNA提取、亚硫酸氢盐（Bisulfite）转化、文库构建和高通量测序四大步骤。首先，从细胞或组织中提取高质量的基因组DNA；随后，使用亚硫酸氢盐处理DNA，将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶保持不变，在后续PCR扩增中转变为胸腺嘧啶（T）。这一化学转化是区分甲基化与非甲基化位点的关键。转化后的DNA经过片段化、末端修复、加A尾、连接测序接头等步骤构建测序文库，最后通过高通量测序获得原始数据。生物信息学分析流程包括数据质控（FastQC）、比对到参考基因组（使用Bismark或BS-Seeker等专用比对工具）、甲基化位点提取、甲基化水平计算（以甲基化C数占总覆盖C数的比例表示）以及DMR分析等。
检测标准
为确保全基因组甲基化测序结果的准确性和可重复性，需遵循一系列技术标准和质量控制指标。首先，起始DNA质量应满足OD260/280在1.8–2.0之间，浓度不低于50 ng/μL，完整性通过DNA Integrity Number（DIN）评估（建议DIN > 7）。亚硫酸氢盐转化效率应高于99%，可通过添加非甲基化控制DNA（如lambda DNA）进行验证。测序数据方面，建议测序深度达到30×以上，以保证每个CpG位点有足够覆盖深度（通常>10×）进行准确甲基化 Calling。Q30碱基比例应大于80%，总数据量根据基因组大小而定，人类基因组通常需要100–200 Gb原始数据。数据分析需采用经过验证的生物信息学流程，并参考公共数据库如NCBI GEO、ENCODE或ICGC中的标准数据集进行比对和验证。此外，实验设计应包括生物学重复（通常不少于3个），以提高统计可信度。
