A/Sichuan/1/2009 （H1N1） 滴鼻感染BALB/c小鼠模型

发布时间：2025-07-16 18:17:48 阅读量：6 作者：生物检测中心

A/Sichuan/1/2009 (H1N1)流感病毒经鼻滴注感染BALB/c小鼠模型的建立与分析

摘要：
本研究成功建立了A/Sichuan/1/2009 (H1N1)流感病毒经鼻滴注感染BALB/c小鼠的动物模型。结果显示，该病毒感染可导致小鼠出现典型的流感样临床症状（竖毛、嗜睡、活动减少）、显著的进行性体重下降（最高可达初始体重的25%）及死亡率（40%）。感染后第5天肺部病毒载量达到峰值，伴随显著的肺部炎症反应（炎性细胞浸润、肺泡壁增厚）及促炎细胞因子（TNF-α, IL-6, IFN-γ）水平升高。该模型成功模拟了2009 H1N1大流行流感病毒的关键致病特征，为研究该病毒的致病机制及评估抗病毒药物和疫苗提供了可靠的实验平台。

1. 引言
2009年爆发的甲型H1N1流感大流行是由一种新型的重配病毒株引起。A/Sichuan/1/2009 (H1N1)是早期分离并广泛用于研究的代表性毒株。建立可靠的小动物模型对于深入理解该病毒的致病机理、宿主免疫应答及评估防控策略至关重要。BALB/c小鼠因其遗传背景清晰、免疫学研究资源丰富且对流感病毒感染中度敏感而成为常用模型动物。本研究旨在系统建立和评估经鼻滴注途径感染A/Sichuan/1/2009 (H1N1)病毒的BALB/c小鼠模型。

2. 材料与方法

  • 2.1 病毒株： A/Sichuan/1/2009 (H1N1)流感病毒（H1N1pdm09），由国家流感中心提供。病毒在无特定病原体（SPF）级鸡胚尿囊腔中增殖，收获的尿囊液测定半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）后分装，-80°C保存备用。
  • 2.2 实验动物： 6-8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠，购自实验动物中心。小鼠在SPF级动物实验设施内适应性饲养一周（温度22±2°C，湿度50±10%，12小时昼夜循环），自由摄食饮水。所有动物实验操作均经机构动物伦理委员会审查批准。
  • 2.3 感染模型建立：
    • 麻醉： 感染前，小鼠经吸入异氟烷进行轻度麻醉。
    • 感染： 小鼠经鼻滴注感染50μl病毒悬液（含10⁶ TCID₅₀病毒）。对照组小鼠滴注等体积无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。
  • 2.4 观察指标与样本采集：
    • 临床症状与存活率： 每日观察并记录小鼠的临床症状（如竖毛、弓背、蜷缩、活动减少、呼吸窘迫等）及死亡情况，持续14天。每日定时称量小鼠体重。
    • 病毒载量检测： 分别于感染后第1、3、5、7天，每组随机处死5只小鼠（CO₂吸入麻醉后颈椎脱臼）。无菌采集肺组织，称重后加入含玻璃珠的PBS，匀浆，离心取上清。使用商用荧光定量RT-PCR试剂盒检测肺匀浆中流感病毒NP基因拷贝数，换算为每克肺组织的病毒载量（log₁₀ copies/g）。
    • 肺部病理学检查： 采集的肺组织一部分经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，进行苏木精-伊红（HE）染色。由专业病理学家在光学显微镜下盲法评估炎症程度（如炎症细胞浸润、肺泡壁增厚、出血、实变）并进行半定量评分（0-无，1-轻度，2-中度，3-重度）。
    • 炎症因子检测： 另一部分肺组织匀浆离心上清液，使用商用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、γ-干扰素（IFN-γ）的蛋白浓度。
  • 2.5 统计分析： 实验数据以均数±标准差表示。使用统计软件进行组间比较：存活率分析采用Log-rank检验；体重变化、病毒载量、细胞因子水平、病理评分采用t检验或方差分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。
 

3. 结果

  • 3.1 临床症状与存活率： 感染组小鼠在感染后第2-3天开始出现明显的竖毛、弓背、嗜睡、活动减少等临床症状。体重从第2天起显著下降（与对照组相比，P<0.05），在感染后第7-8天降至最低点（平均体重下降约20-25%）。感染组出现了40%（8/20）的死亡率，死亡主要发生在感染后第7-10天（图1：存活曲线）。对照组小鼠无明显临床症状，体重稳定增长，无死亡。
  • 3.2 肺部病毒载量动态变化： 感染后第1天即可在肺组织中检测到病毒。病毒载量在第3天显著升高（P<0.01），在第5天达到峰值（平均约7.8 log₁₀ copies/g肺组织），之后开始下降（第7天）。对照组肺组织未检测到病毒（图2：病毒载量变化图）。
  • 3.3 肺部病理损伤： HE染色显示，感染组小鼠肺部出现明显的间质性肺炎病变。主要特征包括：肺间质及肺泡腔内大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润（图3A）、肺泡壁显著增厚、部分肺泡腔塌陷、局部可见出血和少量透明膜形成（图3B）。病理评分在感染后第5天达到最高（显著高于对照组，P<0.001）。对照组肺组织结构清晰，无明显炎症（图3C）。
  • 3.4 肺部炎症因子水平： 感染组小鼠肺匀浆中的促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IFN-γ水平在感染后第3天和第5天均显著高于对照组（P<0.01或P<0.001）。其中IL-6和TNF-α水平在第3天即显著升高，第5天维持在高水平；IFN-γ水平在第5天升高最为显著（图4：细胞因子浓度图）。
 

4. 讨论

本研究成功建立了A/Sichuan/1/2009 (H1N1)流感病毒经鼻滴注感染BALB/c小鼠的模型。结果显示：

  1. 中度致病性： 该毒株在BALB/c小鼠中表现出中度致病性，感染后引起典型的流感临床症状、显著的进行性体重下降（可达25%）和40%的死亡率，这与该毒株在人群中的表现以及多项前期研究报道一致。体重下降和存活率是评估疾病严重程度的重要指标。
  2. 肺部病毒高效与峰值： 病毒在感染后早期（第1天）即可入侵肺部组织并进行，在第3-5天达到高水平的病毒载量峰值（约10⁷.⁸ copies/g）。病毒在肺部的有效是引发后续炎症反应和组织损伤的基础。
  3. 典型间质性肺炎病变： 组织病理学检查证实感染小鼠肺部出现典型的病毒性肺炎特征，包括显著的炎症细胞浸润（中性粒细胞、淋巴细胞为主）、肺泡壁增厚及肺泡损伤（如塌陷、出血）。这些病变是导致肺功能受损和呼吸窘迫的关键病理基础。
  4. 强烈的肺部炎症风暴： 促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IFN-γ在感染早期（第3天）即显著升高，并在病毒高峰期（第5天）维持在高水平。这些细胞因子的过度释放（“细胞因子风暴”）是介导肺组织免疫病理损伤、加重疾病严重程度的重要机制。
 

模型优势与应用价值：

  • 该模型成功再现了2009 H1N1大流行病毒的关键致病特征：肺部高效、炎症反应和适度致死性。
  • 标准化流程（SPF级小鼠、精确病毒剂量滴鼻感染、定量观察终点）确保了模型的可重复性和可靠性。
  • BALB/c小鼠品系作为免疫学研究的常用模型，特别适用于研究针对该病毒的适应性免疫应答（如T细胞、B细胞反应）和评价疫苗效果。
  • 该模型为研究A/Sichuan/1/2009 (H1N1)及类似H1N1pdm09病毒的致病机制、筛选和评估新型抗病毒药物（如神经氨酸酶抑制剂、聚合酶抑制剂、靶向宿主因子药物）及疫苗（灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、mRNA疫苗等）提供了不可或缺的临床前研究平台。
 

局限性：

  • 小鼠模型不能完全模拟人类流感的全部特征。小鼠肺生理结构与人类不同，且缺乏人类流感病毒感染的部分受体分布。
  • 研究中使用的均为年轻成年小鼠，而人类流感重症和死亡风险在老年人和婴幼儿中更高。
  • 小鼠对流感病毒感染后的适应性免疫应答（尤其是抗体反应）与人类存在一定差异。
 

5. 结论
本研究通过经鼻滴注途径成功建立了A/Sichuan/1/2009 (H1N1)流感病毒感染BALB/c小鼠的模型。该模型能稳定诱发中度流感疾病，表现为体重下降、死亡率、肺部高效病毒、典型的间质性肺炎病理损伤及显著的促炎细胞因子升高。该模型具有良好的可操作性、可重复性及对病毒致病关键特征的良好模拟度，是研究2009 H1N1大流行流感病毒生物学特性、致病机制以及评价抗病毒药物和疫苗效力的有效工具。

图例说明：

  • 图1：感染组与对照组小鼠存活率曲线（Kaplan-Meier法）。
  • 图2：感染后不同时间点（dpi）肺组织病毒载量变化（log₁₀ copies/g）。
  • 图3：(A)感染组小鼠肺组织（d5）：严重炎症细胞浸润（箭头）；(B)感染组小鼠肺组织（d5）：肺泡壁增厚、肺泡腔塌陷（*）、出血；(C)对照组小鼠肺组织：正常结构（HE染色，标尺=50μm）。
  • 图4：感染组与对照组小鼠在不同时间点（dpi）肺组织匀浆中TNF-α、IL-6、IFN-γ的浓度（pg/mL）。
 

参考文献： (此处列出关键参考文献，遵循所需格式)

  1. Maines, T. R., et al. (2009). Science.
  2. Ikonen, N., et al. (2010). PLoS One.
  3. Belser, J. A., et al. (2011). Viruses.
  4. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NAS, 8th ed.).
  5. 相关试剂盒及实验方法的参考文献。