祛痰实验（酚红排泌法）（小鼠）

祛痰药效评价实验：小鼠酚红气管排泌法（重点：检测项目）

一、 实验原理

酚红是一种对机体相对无害的指示剂，静脉注射或腹腔注射后，可经血液循环分布到全身组织。在祛痰药研究中，我们利用酚红的一个重要特性：它能从气管粘膜分泌进入气管腔。如果受试药物能促进气管、支气管腺体的分泌功能或加速气管粘膜上皮纤毛的摆动，就能促进酚红更快、更多地随呼吸道分泌物（痰液）排出体外。通过定量检测气管洗出液中酚红的含量，即可间接评价受试药物的祛痰效果。

二、 核心检测项目：酚红含量测定

本实验的核心检测项目是精确测定小鼠气管洗出液中酚红的含量。这是评价药物是否具有促进呼吸道分泌物排出（祛痰）作用的直接量化指标。

检测项目的具体操作流程与要点：

1. 酚红标准曲线的制备 (定量基础)：

   • 试剂： 精确称取一定量的酚红，用适量的生理盐水配制成已知浓度（例如，500 µg/mL）的储备液。
   • 稀释： 将储备液用生理盐水进行梯度稀释（例如，配制浓度为50.0, 25.0, 12.5, 6.25, 3.125 µg/mL的标准溶液）。
   • 碱化反应： 准确吸取各浓度标准溶液适量（例如，0.2 mL）加入干净试管中。向每管中加入 0.1 mL 氢氧化钠溶液（浓度通常为0.1 mol/L或1 mol/L）。
   • 显色与测定：
     • 充分混匀，确保酚红在碱性条件下完全转化为红色的醌式结构。
     • 使用分光光度计，在特定波长（通常为540 nm）下测定各标准溶液的吸光度值（OD值）。
     • 使用生理盐水加等量氢氧化钠溶液作为空白对照调零。
   • 绘图： 以酚红浓度（µg/mL）为横坐标（X轴），对应的吸光度值（OD值）为纵坐标（Y轴），绘制标准曲线。标准曲线应具有良好的线性关系（R²值≥0.99），用于后续未知样品的浓度计算。

2. 小鼠气管洗出液样本的收集与处理：

   • 处死与取材： 末次给药后一定时间（通常在酚红注射后30分钟），用合适的方法（如颈椎脱臼或过量麻醉）处死小鼠。迅速分离颈部皮肤及肌肉，暴露气管。
   • 气管插管固定： 在甲状软骨下方切开一个小口，插入一根连接注射器的套管（如磨平的针头或专用插管），用缝线或夹子固定，防止滑脱和漏液。
   • 灌洗收集： 用注射器吸取预热（约37°C）的生理盐水（通常为0.5 mL或1.0 mL），缓慢注入气管内，停留片刻（如10秒），然后轻轻回抽洗液。重复灌洗操作2-3次（每次使用新鲜生理盐水），尽可能将气管内的酚红及分泌物洗出。
   • 合并洗液： 将所有回收的气管洗出液合并于一支离心管中。记录总洗液体积（V_total，mL）。

3. 气管洗出液中酚红含量的测定：

   • 样本碱化反应： 取适量（例如，0.2 mL）合并后的气管洗出液样本，加入干净试管中。向试管中加入 0.1 mL 氢氧化钠溶液（浓度与标准曲线所用一致）。
   • 显色与测定：
     • 充分混匀。
     • 使用分光光度计，在540 nm波长下测定溶液的吸光度值（OD_sample）。
     • 使用等量生理盐水加等量氢氧化钠作为样本空白对照（反映洗液中可能存在的本底干扰）调零。注意： 此空白对照不同于标准曲线调零用的单纯碱液空白。
   • 浓度计算：
     • 根据测得的样本吸光度值（OD_sample），利用之前绘制的酚红标准曲线方程（通常为线性方程 y = ax + b，y为OD值，x为浓度），计算出该洗出液样本在测定体系中的酚红浓度（C_sample，µg/mL）。
     • 计算总酚红排泌量： 由于样本是稀释后的洗出液，需要计算整个气管洗出液所含的总酚红量。
       • 总酚红排泌量（µg） = C_sample (µg/mL) × V_sample_aliquot (mL) × (V_total (mL) / V_sample_aliquot (mL))
       • 简化后：总酚红排泌量（µg） = C_sample (µg/mL) × V_total (mL)
       • 解释： V_sample_aliquot 是用于测定的那部分洗出液体积（如上例中的0.2 mL）。(V_total / V_sample_aliquot) 是稀释倍数。公式表明最终结果等于测得的浓度乘以洗出液总体积（前提是测定体积具有代表性）。

4. 结果表达：

   • 通常以 “气管酚红排泌量（µg/只）” 作为核心指标，即每只小鼠气管洗出液所含的总酚红微克数。
   • 结果统计分析：实验组（给予祛痰受试药物）与对照组（通常为生理盐水或溶媒对照）的酚红排泌量进行组间比较（常用t检验或ANOVA），以判断药物的祛痰作用是否具有统计学显著性。

三、 辅助检测项目（可选，用于佐证或机理探讨）

1. 呼吸道分泌物的形态学观察：

   • 目的： 直观观察气管内粘液分泌状况。
   • 方法：
     • 处死小鼠后，可不进行灌洗，直接完整剪取一段气管（如从甲状软骨下到气管分叉处）。
     • 沿气管背面纵行剪开，展平于滤纸上。
     • 在解剖显微镜或低倍光学显微镜下观察气管粘膜表面粘液分泌的面积、厚度、粘稠度等。
     • 可进行半定量评分（如：0分=无粘液；1分=少量薄层粘液；2分=中等量粘液；3分=大量粘稠粘液覆盖大部分粘膜）。
   • 与主指标关系： 酚红排泌量增加的同时观察到粘液分泌增多，能更全面地支持药物促进排痰的结论。

2. 气管粘膜上皮纤毛运动观察（离体实验）：

   • 目的： 探讨药物是否通过促进纤毛运动来祛痰。
   • 方法（简化）：
     • 处死小鼠，快速取出气管。
     • 沿背面剪开，制成气管粘膜片。
     • 将粘膜片置于恒温（如37°C）营养液中（常用Krebs-Henseleit液）。
     • 在显微镜下（配备高速摄像机更佳）观测特定区域（如粘膜边缘）纤毛摆动的频率（CBF, ciliary beat frequency） 和协调性。
   • 与主指标关系： 若药物能显著提高CBF，则其祛痰作用（酚红排泌增加）可能与增强纤毛清除功能有关。

四、 关键实验步骤与注意事项

• 动物选择与分组： 通常选用健康成年小鼠（如ICR、KM、BALB/c等品系），体重相近（如18-22g），雌雄各半或单一性别。随机分为对照组（溶媒）、阳性对照组（如氯化铵、盐酸溴己新等已知祛痰药）、受试药物不同剂量组。
• 酚红给药： 剂量（通常为0.5%或5 mg/mL），途径（腹腔注射或尾静脉注射），体积（如0.1 mL/10g体重）。时间点（通常在处死前30分钟给药）。
• 受试药物给药： 根据药物性质（灌胃、腹腔注射等），在酚红注射前给予单次或连续多次给药（急性或长期药效评价）。
• 气管灌洗： 操作需熟练、迅速，避免气管外出血污染样本。灌洗液体积需准确、一致。灌洗动作要轻柔，以减少组织损伤。确保插管在气管腔内，避免灌入食道。
• 分光光度计校准： 确保仪器状态良好，波长准确（540 nm）。每次测定前用空白调零。标准曲线和样本测定最好在同一次实验中完成。
• 统计学分析： 数据以均值±标准差（Mean ± SD）表示。使用适当的统计学方法（如t检验、单因素方差分析及事后多重比较）进行组间差异显著性检验（如 p<0.05 认为有统计学差异）。

五、 总结

在小鼠酚红排泌法祛痰实验中，核心检测项目是精确测定气管洗出液中的酚红含量，并以**“气管酚红排泌量（µg/只）”**作为评价药物祛痰作用的直接、客观的量化指标。该检测依赖于精确制备的酚红标准曲线和准确的分光光度法（540 nm）测量。操作中需严格规范酚红给药、气管灌洗及样本处理步骤。可选辅助检测（如气管粘液评分、纤毛运动观测）可为祛痰机制提供更多信息。此方法是评价药物（尤其是中药、天然产物及合成化合物）促进呼吸道分泌功能或纤毛运动功能的重要药理学手段。

（注： 文中提到的试剂如酚红、氢氧化钠、生理盐水等均为通用化学名称或术语，不涉及任何特定生产厂家或品牌。）