免疫原性试验

免疫原性试验的核心检测项目

免疫原性评估是生物药开发的关键环节，旨在系统评价治疗性蛋白（如单抗、融合蛋白、重组蛋白、酶替代疗法、细胞/基因疗法载体等）引发机体产生不期望免疫应答的风险。这些免疫应答，主要为抗药物抗体（ADA）的产生，可能影响药物的药代动力学、药效学、安全性和临床疗效。以下聚焦免疫原性试验中的核心检测项目：

一、抗药物抗体检测

1. 筛选试验：

   • 目的： 高效检测样品中是否存在潜在的ADA，灵敏度高但可能存在假阳性。
   • 方法： 通常采用高灵敏度的免疫测定平台（如酶联免疫吸附、电化学发光法）。
   • 原理： 将药物（或其相关靶点蛋白）作为捕获抗原固定于固相，加入待测样品。若有ADA存在，则与之结合。加入标记的抗人Ig抗体进行检测，产生信号。
   • 关键参数： 筛选临界值（基于阴性对照群体设定）。

2. 确证试验：

   • 目的： 确认筛选试验阳性样本中检测到的信号确实由特异性ADA引起，排除基质干扰等因素造成的假阳性。
   • 方法： 在筛选试验基础上，加入竞争步骤。
   • 原理： 平行测试两份相同样本：一份不加干预；另一份加入过量的游离药物（或其他特异性竞争试剂）。若过量游离药物能显著抑制样本与固相捕获药物的结合（导致信号降低超过预设的确证临界值），则表明筛选阳性信号源于特异性ADA。
   • 关键参数： 确证临界值。

3. 滴度测定：

   • 目的： 对确证为阳性的样本进行半定量分析，评估ADA水平的高低。
   • 方法： 将确证阳性的样本进行一系列梯度稀释（如2倍、4倍稀释序列）。
   • 原理： 对每个稀释度重复进行筛选或确证试验（通常采用筛选方法）。能产生阳性信号（信号值大于筛选临界值）的最高稀释倍数即为该样本的滴度（如1:256）。滴度越高，通常意味着样本中ADA的浓度越高。
   • 关键参数： 滴度报告形式（终点滴度）。

4. 中和抗体检测：

   • 目的： 评估ADA是否能特异性地阻断药物的生物学活性，这是评估ADA潜在临床影响的最关键指标之一。
   • 方法： 基于药物作用机制设计功能性细胞试验或配体-受体结合抑制试验。
     • 基于细胞的生物测定： 体外模拟药物诱导的生物效应（如细胞增殖、细胞毒性、信号通路激活/抑制、报告基因表达）。将待测样品（含潜在NAb）与药物共孵育后加入反应体系。若ADA中和了药物的活性，则原本由药物诱导的生物效应会被抑制。
     • 基于配体-受体结合： 评估ADA是否阻断药物与其靶抗原（如细胞表面受体、可溶性配体）的结合。常用方法包括竞争性ELISA、表面等离子共振技术等。
   • 关键考量： 方法需具有药物特异性和功能相关性；灵敏度通常低于结合抗体检测；需建立合适的临界值（基于阴性对照或统计模型）以判定中和活性阳性；区分中和与非中和抗体。

5. 同种型分析：

   • 目的： 确定ADA的免疫球蛋白类型（如IgG、IgM、IgA、IgE）及其亚类（如IgG1, IgG4）。
   • 方法： 在结合抗体检测平台（如筛选或滴度检测）中，使用特异性抗人Ig同种型/亚类的二抗代替广谱抗人Ig二抗进行检测。
   • 意义： 不同同种型/亚类可能提示不同的免疫应答阶段或潜在的生物学效应。例如，IgG4常见于长期用药后的免疫耐受，可能与药效降低有关；IgE则与速发型超敏反应风险相关。

二、细胞免疫应答检测

虽然ADA是免疫原性评估的重点，细胞免疫应答在某些情况下（如细胞治疗、基因治疗载体）也至关重要。

1. T细胞增殖与活化检测：

   • 目的： 评估药物或其组分是否激活特异性T细胞。
   • 方法：
     • 淋巴细胞增殖试验： 分离患者外周血单个核细胞，用药物或其潜在T细胞表位多肽刺激，通过检测细胞增殖（如胸腺嘧啶掺入法、CFSE稀释法）或活化标志物表达（如流式细胞术检测CD69, CD25, CD154）来判断。
     • 酶联免疫斑点法： 检测药物刺激后分泌特定细胞因子（如IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-17）的T细胞数量。

2. 细胞因子谱分析：

   • 目的： 全面评估药物刺激引发的免疫细胞分泌的多种细胞因子/趋化因子模式。
   • 方法： 多因子检测平台（如基于Luminex的多重微球流式免疫分析）。
   • 意义： 揭示免疫应答的性质（如Th1型、Th2型、Th17型或调节性T细胞应答）和强度。

三、相关检测要素

1. 样品采集与处理：

   • 采样时间点： 精心设计（如基线、给药后关键时间点、稳态、停药后随访），覆盖免疫应答产生、发展和消退的全过程。
   • 样品类型： 主要是血清或血浆（用于ADA检测）；外周血单个核细胞（用于细胞免疫检测）。
   • 处理与储存： 规范的离心、分装、冷冻（通常-70°C或更低）流程，确保样品稳定性，避免反复冻融。

2. 生物分析方法验证：

   • 核心要求： 所有用于报告决策的检测方法（ADA筛选、确证、滴度、NAb）必须经过严格的方法学验证。
   • 关键验证参数： 选择性/特异性、灵敏度（最低可检测浓度/滴度）、精密度（重复性、中间精密度）、稳健性、药物耐受性（允许在药物存在下检测ADA的能力）、靶标耐受性（当药物靶标为可溶性分子时尤为重要）、临界值建立策略等。

总结

免疫原性试验是一项复杂而精细的系统工程。核心检测项目围绕着抗药物抗体的检测与表征（筛查、确证、滴度、中和活性、同种型）展开，必要时辅以细胞免疫应答（T细胞增殖活化、细胞因子谱）的评估。这些检测结果的解读需要结合规范的样品管理和经过充分验证的分析方法。全面、准确的免疫原性数据对于理解药物的体内行为、评估潜在风险（如疗效丧失、不良反应）以及优化临床给药方案具有至关重要的作用，是保障生物药物治疗安全性和有效性的基石。