抗氧化测试（细胞）

发布时间：2025-06-09 14:54:37 阅读量：3 作者：生物检测中心

细胞抗氧化测试：核心检测项目详解

一、 细胞内活性氧（ROS）水平检测

  • 核心原理： 利用荧光探针（如DCFH-DA、DHE）或化学发光法，直接检测细胞内产生的超氧阴离子、过氧化氢等主要ROS。
  • 检测指标：
    • 荧光强度/化学发光值： 直接反映细胞内ROS的瞬时水平。
    • 荧光显微镜成像： 直观观察ROS在细胞内的分布。
  • 意义： 最直接的氧化应激指示剂。评价受试物质能否有效清除ROS或抑制ROS生成。

二、 细胞抗氧化酶活性测定 评估细胞自身防御系统的关键酶：

  • 超氧化物歧化酶 (SOD)：
    • 方法： 抑制氮蓝四唑（NBT）光化还原法、WST法等。
    • 意义： 清除超氧阴离子的第一道防线。活性升高常表示抗氧化应激增强。
  • 谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx)：
    • 方法： 以谷胱甘肽（GSH）和过氧化氢/有机过氧化物为底物，检测NADPH消耗速率（偶联法）或DTNB法测GSH消耗。
    • 意义： 催化过氧化物还原，保护细胞膜和组分免受氧化损伤。
  • 过氧化氢酶 (CAT)：
    • 方法： 紫外分光光度法（检测H₂O₂在240nm的分解速率）。
    • 意义： 专一高效分解过氧化氢。
  • 谷胱甘肽还原酶 (GR)：
    • 方法： 检测NADPH在340nm的消耗速率。
    • 意义： 将氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原为还原型（GSH），维持GSH库。
  • 谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)：
    • 方法： 以GSH和CDNB（1-氯-2,4-二硝基苯）为底物，检测340nm产物生成。
    • 意义： 参与亲电子物质解毒，间接抗氧化。

三、 非酶抗氧化剂含量测定

  • 还原型谷胱甘肽 (GSH) 与氧化型谷胱甘肽 (GSSG)：
    • 方法： DTNB法（测总GSH和GSSG，计算GSH/GSSG比值）、HPLC、荧光法。
    • 意义： GSH是最重要的细胞内非酶抗氧化剂，直接清除自由基、参与解毒。GSH/GSSG比值是关键的氧化还原状态指标，比值下降表明氧化应激。
  • 维生素C (抗坏血酸, AsA) 与维生素E (生育酚)：
    • 方法： HPLC（常用）、荧光法、比色法。
    • 意义： 重要的脂溶性和水溶性抗氧化维生素，保护膜脂质和胞浆成分。

四、 氧化损伤生物标志物检测 评估氧化应激导致的细胞损伤程度：

  • 脂质过氧化产物：
    • 丙二醛 (MDA)：
      • 方法： 硫代巴比妥酸反应物法（TBARS，在532nm检测）， HPLC法。
      • 意义： 细胞膜磷脂中多不饱和脂肪酸过氧化的主要终产物，常用作脂质过氧化标志。
    • 4-羟基壬烯醛 (4-HNE)：
      • 方法： ELISA、HPLC、Western Blot（检测其蛋白加合物）。
      • 意义： 更具反应活性的脂质过氧化终产物，可引起蛋白质损伤。
  • 蛋白质氧化损伤：
    • 蛋白质羰基：
      • 方法： DNPH（2,4-二硝基苯肼）衍生化法，在370nm检测。
      • 意义： 蛋白质被ROS攻击后产生羰基（醛酮基），是蛋白质氧化损伤的广泛标志。
    • 硝基酪氨酸：
      • 方法： ELISA、免疫组化、Western Blot。
      • 意义： 蛋白质酪氨酸残基被过氧亚硝基阴离子等强氧化剂硝化的产物，特异性较高。
  • DNA氧化损伤：
    • 8-羟基脱氧鸟苷 (8-OHdG)：
      • 方法： ELISA、HPLC-ECD（电化学检测）、LC-MS/MS。
      • 意义： DNA中鸟嘌呤被羟基自由基氧化后的主要产物，是DNA氧化损伤的经典生物标志物。

五、 细胞活力与功能评估 抗氧化保护的最终目标是维持细胞活力与功能：

  • 细胞活性/存活率：
    • 方法： MTT/XTT/WST法（线粒体功能）、台盼蓝染色（质膜完整性）、LDH释放（细胞毒性）。
    • 意义： 评价受试物质在氧化应激条件下保护细胞免于死亡的能力。
  • 细胞凋亡/坏死检测：
    • 方法： Annexin V/PI双染流式细胞术、Caspase活性检测、TUNEL法。
    • 意义： 区分氧化应激诱导的细胞死亡模式（程序性死亡或坏死）。

六、 氧化还原相关基因与蛋白表达分析

  • 方法： RT-qPCR、Western Blot、免疫荧光染色。
  • 检测目标： Nrf2及其下游抗氧化酶基因（HO-1, NQO1, GCLC, GCLM等）、Keap1、NF-κB等信号通路关键分子。
  • 意义： 揭示受试物质是否通过激活抗氧化防御相关的信号通路（如经典的Nrf2/ARE通路）来发挥保护作用。

应用与选择策略：

  • 综合评估： 单一指标不足以全面反映抗氧化效果，通常需要组合多项指标（如ROS水平 + 抗氧化酶活性 + 氧化损伤标志物 + 细胞活力）。
  • 针对性： 根据受试物质特性（如脂溶性/水溶性）、研究目的（机制探索/效果评价）和诱导氧化应激的方式选择合适的检测项目。
  • 机制探究： 基因蛋白表达分析有助于阐明深层次的分子作用机制。

结论： 细胞抗氧化测试是一个多维度、多指标的评价体系。通过精准检测细胞内ROS水平、关键抗氧化酶活性、核心抗氧化物质含量、氧化损伤生物标志物以及细胞功能状态，并结合信号通路分析，能够全面、客观地揭示受试物质在细胞层面的抗氧化效能及其潜在作用机制，为功能性食品、药物开发和健康研究提供重要的科学依据。选择合适的检测组合是获得可靠结论的关键。