抗氧化功效评价

发布时间：2025-06-09 10:50:43 阅读量：6 作者：生物检测中心

抗氧化功效评价：核心检测项目解析

抗氧化功效评价旨在衡量物质清除自由基、抑制氧化反应的能力，是食品、保健品、化妆品、医药等领域产品研发与质量控制的核心环节。其评价体系依赖于一系列科学、标准的检测项目，以下按不同检测原理与层次分类详解：

一、 体外化学法检测 (基于自由基清除能力)

此类方法操作简便、快速、经济，是初步筛选和常规检测的首选。

  1. DPPH自由基清除率测定

    • 原理： 利用稳定的有机自由基 DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 在517nm处有强吸收。抗氧化物质提供电子或氢原子使其褪色，吸光度下降程度反映清除能力。
    • 指标： IC₅₀ (清除50%自由基所需样品浓度)、清除率(%)。

  2. ABTS⁺自由基清除能力测定

    • 原理： 氧化生成的蓝绿色阳离子自由基 ABTS⁺在734nm处有特征吸收。抗氧化物质使其褪色，吸光度变化与抗氧化能力正相关。
    • 指标： TEAC (Trolox等效抗氧化能力)、IC₅₀、清除率(%)。相比DPPH，水溶性和脂溶性物质均适用。

  3. FRAP (铁离子还原抗氧化能力)

    • 原理： 测定在酸性条件下，样品将Fe³⁺-三吡啶三嗪络合物(Fe³⁺-TPTZ)还原为蓝色Fe²⁺络合物的能力，在593nm处检测吸光度增加。
    • 指标： 结果通常以FeSO₄或Trolox当量表示。

  4. ORAC (氧自由基吸收能力)

    • 原理： 模拟生理条件下，样品抑制荧光探针(如荧光素)被自由基(常用AAPH)氧化而荧光衰减的能力与时间，计算荧光衰减曲线下面积(AUC)。
    • 指标： 结果以Trolox当量表示。因其引入了反应动力学参数，被认为生物相关性较高。

  5. 总酚含量测定 (Folin-Ciocalteu法)

    • 原理： 基于多酚类物质在碱性条件下还原磷钼钨酸试剂，生成蓝色络合物，在765nm左右检测。
    • 指标： 结果常以没食子酸当量(GAE)表示。虽然不是直接测抗氧化能力，但总酚含量常与抗氧化活性显著正相关。

  6. 总抗氧化能力 (T-AOC) 试剂盒测定

    • 原理： 基于样品将Fe³⁺还原为Fe²⁺，后者与菲啰嗪生成橙色络合物，在520nm检测。可快速综合评价样品的总还原能力。
    • 指标： 结果常以单位体积/质量的抗氧化能力表示（如U/mL, U/g）。

二、 基于脂质氧化抑制能力的检测

模拟或加速生物体系或食品中的脂质氧化过程，评估抗氧化剂的实际保护效果。

  1. β-胡萝卜素漂白法

    • 原理： 在含亚油酸（不饱和脂肪酸）的乳液中，β-胡萝卜素（模拟脂质）在加热和有氧条件下被自由基氧化褪色。抗氧化剂延缓褪色速度。
    • 指标： 抗氧化活性(AA%)、抑制率(%)。

  2. 硫代巴比妥酸反应物测定 (TBARS / MDA测定)

    • 原理： 脂质过氧化的终产物丙二醛(MDA)与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成粉红色化合物，在532nm处检测。
    • 指标： MDA浓度、抑制率(%)。广泛用于组织匀浆、血清、细胞及油脂氧化程度的评价。

  3. Rancimat法 / 氧化诱导时间测定

    • 原理： 将油脂或含油脂样品在高温下通空气加速氧化，测定挥发性酸（主要是甲酸）的产生导致电导率突增的时间（诱导期）。
    • 指标： 氧化诱导时间(IP, h)。是评价油脂及含油食品抗氧化性能的标准方法之一。

三、 细胞水平抗氧化活性检测 (Cellular Antioxidant Activity, CAA)

更接近生理环境，评估抗氧化物质在细胞内的活性。

  1. DCFH-DA 探针法

    • 原理： 非荧光探针DCFH-DA进入细胞后被酯酶水解为DCFH，细胞内活性氧(ROS)将其氧化为荧光物质DCF。抗氧化剂预处理细胞可抑制荧光产生。
    • 指标： 荧光强度、抑制率(%)、CAA值（量化单位）。

  2. 细胞氧化损伤保护模型

    • 原理： 用氧化应激诱导剂（如H₂O₂, t-BHP, AAPH）处理细胞造成损伤（活力下降、凋亡、脂质过氧化、蛋白质氧化、DNA损伤等），评价抗氧化剂预处理对损伤的保护作用。
    • 指标： 细胞存活率(MTT/CCK-8法)、LDH释放率、细胞凋亡率、抗氧化酶活性(SOD, CAT, GSH-Px)、TBARS/MDA含量、8-OHdG（DNA氧化损伤标志物）水平等的变化。

四、 生化指标检测 (常用于动物实验或人体研究)

评价抗氧化物质在生物体内系统性效应。

  1. 抗氧化酶活性：
    • 超氧化物歧化酶 (SOD)： 清除超氧阴离子自由基。
    • 过氧化氢酶 (CAT)： 分解过氧化氢。
    • 谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)： 利用还原型谷胱甘肽(GSH)还原过氧化物（包括脂质过氧化物）。
  2. 非酶抗氧化剂水平：
    • 还原型谷胱甘肽 (GSH)： 重要的细胞内抗氧化剂和解毒剂。
    • 维生素C (抗坏血酸)、维生素E (生育酚)： 关键的膳食抗氧化维生素。
  3. 氧化损伤标志物：
    • 丙二醛 (MDA)： 脂质过氧化终产物（常用TBARS法测）。
    • 蛋白质羰基含量： 蛋白质氧化损伤的标志。
    • 8-羟基脱氧鸟苷 (8-OHdG)： DNA氧化损伤的标志（常用ELISA或HPLC-ECD测）。
    • 总氧化状态 (TOS) / 氧化应激指数 (OSI)： 综合反映体内氧化压力。

方法选择的关键考量因素：

  1. 测试对象性质： 水溶性还是脂溶性抗氧化剂？成分单一还是复杂混合物？
  2. 关注机制： 侧重自由基清除？金属离子螯合？还是抑制脂质过氧化链式反应？
  3. 相关性需求： 只需快速体外初筛？还是需要接近生理环境的细胞或体内验证？
  4. 资源与条件： 实验设备、试剂成本、操作复杂度和时间要求。
  5. 标准化与可比性： 优先选择国际或国内广泛认可的标准方法。

结论：

抗氧化功效的评价是一个多维度、多层次的过程。没有单一的金标准方法能全面反映物质的抗氧化能力。 最有效的策略是根据样品特性和评价目的，组合应用多种化学法、基于脂质氧化抑制的方法以及细胞水平甚至动物水平的生物学评价方法，才能获得更全面、更可靠、更具生理相关性的抗氧化功效数据。体外化学法（如DPPH, ABTS, FRAP, ORAC）是基础且重要的筛选工具，而基于脂质氧化的方法（如TBARS, Rancimat）和细胞水平检测（如CAA）则能提供更接近实际应用场景的信息。在高级研究中，体内生化指标的检测是评价整体抗氧化效果和健康效应的关键环节。