免疫细胞增殖试验：原理、方法与意义
免疫细胞增殖是免疫应答的核心环节，反映了免疫细胞（如T细胞、B细胞）在识别抗原或受到刺激后活化和扩增的能力。评估这种增殖能力对于理解免疫系统功能、疾病机制（如免疫缺陷、自身免疫病、肿瘤免疫逃逸）、疫苗效力评价以及免疫治疗药物筛选至关重要。免疫细胞增殖试验便是在体外定量检测这种能力的关键技术。
一、 基本原理
免疫细胞在静息状态下处于细胞周期的G0期。当受到特异性抗原、多克隆激活剂（如植物血凝素PHA、刀豆蛋白A ConA用于T细胞；脂多糖LPS、葡萄球菌蛋白A用于B细胞）、或通过抗体交联表面受体（如抗CD3/CD28抗体）等刺激后，细胞会活化并进入细胞周期，进行DNA（S期）和细胞分裂（G期），最终导致细胞数量显著增加。增殖试验通过检测细胞在刺激后特定时间点的代谢活性、DNA合成或细胞分裂情况来量化增殖程度。
二、 常用检测方法
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代谢活性检测法 (如MTT法、XTT法、CCK-8法)：
- 原理： 活细胞线粒体内的脱氢酶能将特定的水溶性四唑盐（如MTT, XTT, WST-8）还原成不溶于水的有色甲臜结晶（MTT形成蓝紫色结晶，XTT和WST-8形成橙黄色水溶性产物）。甲臜的生成量与活细胞数量及代谢活性成正比。
- 操作流程：
- 分离目标免疫细胞（如外周血单个核细胞PBMC）。
- 将细胞接种于培养板孔中，设置未刺激组（阴性对照）、刺激组（加入特定刺激剂）和可能需要的阳性对照组（如PHA刺激PBMC）。
- 在适宜条件下（通常37°C, 5% CO2）培养一定时间（如48-96小时，取决于细胞类型和刺激强度）。
- 培养结束前数小时（如4-6小时），加入MTT溶液。
- 培养结束后，弃去培养上清（MTT法需加入溶解剂溶解甲臜结晶），使用酶标仪在特定波长（如MTT法570nm，参比波长630nm；CCK-8法450nm）下测定吸光度值。
- 优点： 操作相对简便、经济、高通量，无需特殊设备，结果稳定。
- 缺点： 检测的是细胞整体代谢活性，不能区分增殖细胞的具体状态（如处于细胞周期哪个阶段），可能受细胞毒性或代谢状态变化的影响。
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DNA合成检测法 (如³H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法、BrdU掺入法)：
- 原理： 细胞在增殖过程中进行DNA，需要大量合成DNA。将放射性标记的³H-胸腺嘧啶脱氧核苷或非放射性的溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）加入培养基，它们会被增殖细胞摄入并掺入到新合成的DNA链中。通过检测掺入量即可反映DNA合成速率和细胞增殖水平。
- 操作流程 (以³H-TdR为例)：
- 细胞分离、接种、刺激培养（同代谢活性法）。
- 培养结束前数小时（通常6-18小时），向每孔加入含³H-TdR的培养液。
- 培养结束后，收集细胞于玻璃纤维滤膜上，用液体闪烁仪检测滤膜上的放射性强度（计数每分钟, cpm）。
- 操作流程 (以BrdU为例 - ELISA法)：
- 细胞分离、接种、刺激培养，并在培养结束前加入BrdU。
- 培养结束后，固定细胞，通常用抗BrdU单克隆抗体进行免疫检测（如ELISA），通过酶促显色反应测定吸光度值。
- 优点： 直接检测DNA合成，是评估细胞增殖的“金标准”之一；BrdU法避免了放射性污染。
- 缺点： ³H-TdR法涉及放射性物质，操作和废物处理要求高；两种方法都需要在培养后期加入标记物，只能反映标记期间的DNA合成情况；BrdU掺入后的检测步骤相对繁琐。
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流式细胞术分析法 (如CFSE稀释法、Ki-67/DAPI染色法)：
- 原理：
- CFSE稀释法： 羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料。它进入活细胞后，其乙酸基团被胞内酯酶水解，生成带负电荷的荧光分子并被滞留在胞内。CFSE通过其琥珀酰亚胺酯基团与细胞内的游离氨基（主要是赖氨酸）共价结合，形成稳定的荧光标记。当细胞分裂时，标记的CFSE平均分配到两个子代细胞中，导致每个子代细胞的荧光强度减半。通过流式细胞仪检测细胞群荧光强度的逐代递减，即可精确追踪细胞分裂的次数和增殖比例。
- Ki-67/DAPI染色法： Ki-67是一种存在于增殖期细胞（G1, S, G2, M期）核内的蛋白质，静止期（G0期）细胞不表达。通过荧光标记的抗Ki-67抗体结合DAPI（染DNA）进行流式分析，可区分处于细胞周期不同阶段的细胞比例（G0/G1, S, G2/M）。
- 操作流程 (以CFSE法为例)：
- 分离细胞，用CFSE染色液染色。
- 洗涤去除多余染料。
- 将标记好的细胞接种、刺激培养。
- 培养结束后，收集细胞，上流式细胞仪检测荧光强度分布。通过软件分析，可得到分裂次数、各代细胞比例、增殖指数等信息。
- 优点： 能提供最丰富的信息，包括细胞分裂次数、增殖比例、细胞周期分布、并可结合表面标志进行多参数分析，区分不同细胞亚群的增殖情况；CFSE法能动态追踪细胞分裂史。
- 缺点： 设备昂贵（需流式细胞仪），操作技术要求较高，数据分析相对复杂；CFSE染色对细胞活性可能有轻微影响。
- 原理：
三、 实验设计与关键注意事项
- 细胞来源与制备： 人（外周血、脾脏、淋巴结等）或动物（小鼠、大鼠等）来源的免疫细胞。需无菌操作，注意细胞活性（通常>90%）。分离方法（如密度梯度离心）需根据目标细胞类型选择。
- 刺激剂选择与浓度： 根据研究目的选择合适的刺激剂（抗原、有丝分裂原、抗体等）。必须进行预实验优化刺激剂浓度和刺激时间，避免浓度过高导致细胞毒性或过低导致刺激不足。设置未刺激组作为阴性对照。
- 细胞密度： 细胞接种密度至关重要。密度过低可能导致增殖信号不足或细胞死亡；密度过高可能导致营养竞争或接触抑制，影响增殖。需通过预实验确定最佳密度。
- 培养条件： 使用合适的培养基（如RPMI 1640）、血清（如胎牛血清）、补充因子（如L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇）。保持稳定的温度（37°C）、湿度、CO2浓度（5%）。培养时间根据方法选择（代谢法48-96h，DNA合成法通常48-72h加入标记物，流式法CFSE可追踪多天）。
- 重复与对照： 实验需设置生物学重复和技术重复。关键对照包括：
- 未刺激组 (阴性对照)： 反映基础增殖水平。
- 刺激组： 实验组。
- 阳性对照组： 使用强刺激剂（如PHA刺激PBMC）证明细胞具有增殖能力。
- 背景/空白对照： 仅含培养基和试剂，不含细胞，用于校正背景信号。
- 数据分析： 结果通常以刺激指数（Stimulation Index, SI = 刺激组均值 / 未刺激组均值）或增殖率（%）表示。使用统计学方法（如t检验、方差分析）比较组间差异是否显著。流式数据需专业软件分析。
四、 应用与意义
- 基础免疫学研究： 阐明T细胞、B细胞等免疫细胞活化和增殖的信号通路、调控机制。
- 临床免疫评估： 诊断免疫缺陷病（如SCID患者淋巴细胞增殖能力低下），监测自身免疫病活动状态，评估器官移植受者的免疫状态（排斥风险）。
- 疫苗研发与评价： 检测疫苗接种后特异性T细胞或B细胞的增殖反应，评估疫苗的免疫原性。
- 肿瘤免疫学： 研究肿瘤微环境对免疫细胞功能的抑制（如T细胞耗竭、增殖无能），评估免疫检查点抑制剂等免疫治疗药物恢复T细胞增殖能力的效果。
- 药物筛选与毒性评价： 筛选具有免疫调节活性的药物（免疫增强剂或免疫抑制剂），评估药物对免疫细胞增殖的潜在毒性。
五、 总结
免疫细胞增殖试验是免疫学研究与应用不可或缺的工具。从经典的³H-TdR掺入法到高通量的代谢活性检测法，再到能提供丰富信息的流式细胞术分析，多种方法各有优劣，研究者需根据实验目的、样本类型、设备条件和所需信息深度进行选择。严谨的实验设计、规范的实验操作、合理的对照设置和准确的数据分析是获得可靠结果的关键。深入理解免疫细胞增殖的动态变化，为揭示免疫系统奥秘、攻克相关疾病提供了重要的科学依据。