角质形成细胞增殖试验：原理、方法与应用
引言
角质形成细胞是表皮的主要构成细胞，负责形成皮肤屏障、参与免疫应答和创伤修复。其增殖能力的评估在皮肤生物学基础研究、药物开发（如促伤口愈合药、抗银屑病药、防晒剂功效评价）、毒理学（如化学品皮肤刺激性/腐蚀性评价）以及疾病机制研究（如银屑病、皮肤癌）中至关重要。角质形成细胞增殖试验通过体外定量检测细胞分裂速率，为这些研究提供关键数据。
一、 试验原理
该试验基于测量处于活跃增殖状态的细胞数量或反映细胞代谢活性的指标。常用原理包括：
- 直接细胞计数法： 在特定时间点消化细胞并计数，计算细胞倍增时间或绘制生长曲线。
- 代谢活性检测 (如 MTT/XTT/CCK-8法)： 活细胞线粒体中的脱氢酶能将水溶性四唑盐（如MTT、XTT、WST-8）还原为不溶于水的甲臜（Formazan）结晶或水溶性的甲臜染料。甲臜的生成量与活细胞数量和代谢活性成正比，可通过比色法测定吸光度值（OD值）进行定量。
- DNA合成检测 (如 BrdU/EdU掺入法)： 在细胞培养期间加入胸腺嘧啶核苷类似物（如5-溴-2’-脱氧尿嘧啶核苷BrdU或5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶EdU）。增殖细胞在DNA合成期（S期）会将这些物质掺入新合成的DNA中。通过特异性抗体（BrdU）或点击化学反应（EdU）进行标记和检测，可量化正在进行DNA合成的细胞比例。
- 增殖相关抗原检测 (如 Ki-67/PCNA)： 使用特异性抗体检测在细胞周期G1、S、G2和M期表达，但在G0期不表达的增殖标志蛋白（如Ki-67, 增殖细胞核抗原PCNA），通过免疫细胞化学或流式细胞术进行定量。
二、 试验方法
以下以代谢活性检测（CCK-8法）为例，详述常规操作流程：
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细胞准备：
- 来源：原代角质形成细胞（如新生儿包皮分离）或永生化角质形成细胞系（如HaCaT）。
- 培养：使用专用培养基（如含低钙浓度的角质形成细胞无血清培养基，添加生长因子和牛垂体提取物），在37°C、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。
- 传代：细胞达到约80%汇合度时，用胰蛋白酶-EDTA溶液消化，离心重悬后计数。
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铺板与处理：
- 将细胞悬液以预实验确定的适当密度（通常在5×10³至1×10⁴个细胞/孔之间）均匀接种于96孔板（保证孔间一致性对结果至关重要），每孔加入一定体积的完全培养基（如100 μL）。
- 将培养板置于培养箱中预培养（如24小时），使细胞贴壁并进入对数生长期。
- 吸弃旧培养基，加入含不同浓度待测化合物（药物、生长因子、刺激物、抑制剂等）或对照（如空白培养基、溶剂对照、阳性刺激对照）的新鲜培养基。每个处理组设置至少3个复孔。
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培养与检测：
- 将培养板放回培养箱继续培养设定的时间（如24、48或72小时，根据实验目的和细胞特性确定）。
- 培养结束前，配制CCK-8工作液：将CCK-8试剂按说明书比例（通常10%）加入基础培养基或无血清培养基中混匀。
- 吸弃孔内原有培养基。
- 每孔小心加入CCK-8工作液（如100 μL），避免产生气泡。
- 将培养板放回培养箱避光孵育适当时间（通常1-4小时，需预实验确定最佳显色时间）。
- 孵育结束后，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD450nm）。参考波长通常为600-650nm。
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数据分析：
- 计算复孔的平均OD值。
- 处理组细胞增殖率通常表示为相对于对照组（如溶剂对照组）的百分比：
细胞增殖率 (%) = [(OD处理组 - OD空白组) / (OD对照组 - OD空白组)] × 100%
(其中空白组为仅含CCK-8工作液无细胞的孔)。 - 绘制剂量-效应曲线或时间-效应曲线。
- 计算IC50（抑制50%增殖所需的浓度）或EC50（刺激增殖达50%最大效应所需的浓度）等参数（如适用）。
- 使用统计学方法（如t检验、ANOVA）分析组间差异的显著性。
三、 结果解读与应用
- 促增殖效应： 若处理组的增殖率显著高于对照组，表明该处理（如某种生长因子、药物）具有促进角质形成细胞增殖的作用。这在评估促伤口愈合药物、研究生长因子功能等方面应用广泛。
- 抑增殖效应： 若处理组的增殖率显著低于对照组，表明该处理具有抑制角质形成细胞增殖的作用。抗银屑病药物（如甲氨蝶呤、维A酸类药物）通常通过抑制表皮过度增殖发挥作用。评估化学品皮肤刺激性/腐蚀性时，显著的抑制增殖是潜在毒性的指标。
- 疾病模型研究： 在构建银屑病、皮肤癌等疾病体外模型时，检测细胞增殖状态是评价模型成功与否及研究致病机制的重要环节。
- 药物筛选与机制研究： 高通量筛选调节角质形成细胞增殖的候选化合物，并进一步研究其作用机制（如通过检测细胞周期分布、凋亡、信号通路激活等）。
四、 方法学优势与局限性
- 优势：
- 灵敏度高： 可检测微小的增殖变化。
- 通量高： 适用于96孔板或384孔板，便于大规模筛选。
- 相对简便快速： 操作步骤标准化，耗时相对较短（尤其CCK-8法）。
- 定量客观： 结果通过仪器读取，数据客观。
- 局限性：
- 体外局限性： 结果不能完全等同于体内复杂的生理环境（缺乏细胞间相互作用、免疫调控等）。
- 间接性 (代谢法)： MTT/CCK-8等法反映的是细胞代谢活性，虽与增殖相关，但也受细胞活力、线粒体功能等因素影响，并非直接计数分裂细胞。需结合其他方法（如BrdU）或形态学观察确认。
- 干扰因素： 待测化合物本身的颜色、对酶活性的直接影响、细胞毒性引起的早期凋亡/坏死等都可能干扰结果（尤其代谢法）。设置严格的对照至关重要。
- 细胞状态依赖性： 结果受细胞代次、铺板密度、血清批次、培养基成分等因素影响，需严格标准化实验条件。
五、 实验优化与注意事项
- 细胞密度优化： 铺板密度过高导致接触抑制，过低则增殖信号弱。必须通过预实验确定最佳密度，使对照组在检测时处于对数生长期中期。
- 培养时间确定： 处理时间过短可能效应未显现，过长可能导致对照组进入平台期或处理组毒性累积。需根据处理性质和实验目的优化。
- 血清/生长因子： 培养基中血清浓度或特定生长因子的有无会显著影响基础增殖率。实验设计需明确并保持一致。
- 对照设置：
- 空白对照： 仅含培养基和CCK-8试剂，无细胞。
- 溶剂对照 (Vehicle control)： 含溶解待测物所用溶剂（如DMSO、乙醇）的最高浓度，浓度需不影响细胞增殖。
- 阳性对照： 使用已知的促增殖剂（如EGF）或抑增殖剂（如丝裂霉素C），验证实验体系的敏感性。
- 避免边缘效应： 96孔板边缘孔因蒸发等原因可能导致结果偏差。通常使用板内圈孔，外圈孔加PBS或水，或使用专用防蒸发板盖。
- 操作轻柔： 加样、换液、加CCK-8时避免吹打产生气泡或损伤贴壁细胞。
- 无菌操作： 全程注意无菌，避免污染。
六、 结语
角质形成细胞增殖试验是皮肤生物学和皮肤药理学研究中的一项基础而强大的技术。通过选择合适的检测方法（如CCK-8、BrdU等），结合严谨的实验设计和规范的标准化操作，该试验能够可靠地定量评估各种理化因素、生物因子或药物对表皮细胞增殖能力的影响。深入理解其原理、熟练掌握操作细节并客观分析结果，对于阐明皮肤生理病理机制、开发新型皮肤病诊疗策略以及评估外用产品的安全性和功效性具有不可替代的价值。随着检测技术的不断发展和多组学方法的整合，该试验将在未来皮肤研究中继续发挥核心作用。
声明： 本实验描述仅用于科学研究和教育目的。所有体外实验使用的细胞来源应符合相关伦理规范。涉及动物或人体组织来源的原代细胞，需获得相应的伦理审查批准。