脱氧核糖核酸酶检测

发布时间：2025-07-04 15:35:14 阅读量：1 作者：生物检测中心

脱氧核糖核酸酶检测：原理、方法与临床意义

脱氧核糖核酸酶（Deoxyribonuclease，简称 DNase）是一类能水解DNA分子中磷酸二酯键的核酸酶，在多种生物学过程中扮演关键角色。检测DNase活性或表达水平在临床诊断和基础研究中具有重要意义。

DNase概述

DNase主要分为两大类：

  • DNase I：分泌型核酸酶，常见于胰脏、唾液、血清等体液中，依赖钙镁离子，生理状态下切割双链DNA产生带5’磷酸末端的寡核苷酸片段。
  • DNase II：溶酶体型酸性核酸酶，存在于巨噬细胞、脾脏等，不依赖二价金属离子，切割产生带3’磷酸末端的产物。
 

DNase检测的主要方法

DNase活性的检测基于其核心功能——水解DNA底物。常用方法包括：

  1. 定性检测法（琼脂糖扩散法/斑点法）

    • 原理： 将DNA掺入琼脂糖凝胶中制成平板。待测样本（如细菌培养滤液、血清）点样于孔中或滤纸片上。孵育后，DNase活性区域因DNA降解，经特定染料（如甲苯胺蓝、甲基绿）染色后呈现无色透明区带或斑点。
    • 优点： 简便快捷，成本低，适合大量样本初筛（如特定致病菌的DNase试验鉴定）。
    • 缺点： 半定量，灵敏度较低。

  2. 定量检测法

    • 分光光度法（甲基绿法）：
      • 原理： 甲基绿染料与双链DNA结合后在特定波长（通常~620nm或~656nm）有强吸收。DNase水解DNA导致结合染料减少，溶液吸光度下降。下降速率与酶活性正相关。
      • 优点： 操作相对简便，可实现动力学定量。
      • 缺点： 染料特异性受干扰因素影响（如单链核酸、某些离子）。
    • 荧光分析法：
      • 原理： 使用荧光标记的DNA底物（如FITC-dsDNA或分子信标）。DNase切割底物导致荧光信号显著增强或改变（如从淬灭状态释放荧光）。监测荧光强度变化速率计算酶活。
      • 优点： 灵敏度高、特异性好、适用于高通量和实时监测。
      • 缺点： 标记底物成本较高。
    • 酶联免疫吸附法（ELISA）：
      • 原理： 利用特异性抗体捕获样本中的DNase蛋白（如DNase I），再通过酶标二抗和显色底物进行定量检测。检测的是蛋白质浓度而非直接酶活。
      • 优点： 特异性高，可区分不同类型DNase。
      • 缺点： 检测的是蛋白量，不一定完全反映酶活性（可能受抑制剂等影响）。
    • 免疫比浊法：
      • 原理： 样本中的DNase I与包被有特异性抗体的乳胶颗粒结合，形成免疫复合物导致浊度增加。通过测定浊度变化定量DNase I浓度。
      • 优点： 自动化程度高，速度快，适用于临床实验室大批量检测。
      • 缺点： 同样检测的是蛋白浓度而非直接酶活。

  3. 分子生物学方法

    • 原理： 通过RT-qPCR或Northern Blot检测DNase基因（如DNASE1, DNASE1L3, DNASE2）的mRNA表达水平；或通过Western Blot检测蛋白表达水平。
    • 应用： 主要用于研究基因表达调控、遗传突变分析等。
 

DNase检测的临床意义

  1. 细菌鉴定： DNase试验是鉴别某些致病菌的重要生化指标。例如：

    • 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）通常DNase阳性，而表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）通常阴性。
    • 粘质沙雷菌（Serratia marcescens）DNase阳性有助于与其他肠杆菌区分。

  2. 自身免疫性疾病：

    • 系统性红斑狼疮（SLE）： 大量研究表明，部分SLE患者血清中存在功能性DNase I活性降低或DNase I/ DNase1L3蛋白水平下降。这被认为与体内凋亡细胞碎片（含DNA）清除障碍、刺激产生抗核抗体（ANA）和抗dsDNA抗体有关，是疾病发生发展的重要机制之一。检测血清DNase活性或浓度可能作为评估SLE活动性或治疗反应的潜在生物标志物。
    • 抗DNase B抗体：是A组链球菌感染后产生的抗体，检测其滴度有助于诊断链球菌感染后遗症（如风湿热、肾小球肾炎）。

  3. 肿瘤：

    • DNase活性变化与肿瘤发生发展存在关联。某些肿瘤组织或患者血清中DNase活性可能出现异常（升高或降低），其机制和作为肿瘤标志物的价值仍在研究中。

  4. 其他疾病：

    • DNase II活性缺陷与某些炎症性疾病有关。
    • DNase在细胞凋亡、坏死性炎症中都参与细胞外DNA的清除，其活性障碍可能参与多种疾病的病理过程。
 

检测注意事项

  • 样本类型： 血清/血浆最常用（检测循环DNase I）。也可是组织匀浆液、细胞裂解液、细菌培养上清液、唾液等。需注意抗凝剂选择（如EDTA螯合Mg²⁺抑制DNase I活性，肝素可能干扰）。
  • 样本处理与保存： 避免反复冻融。尽快分离血清/血浆，低温保存（通常-20℃或-80℃）。
  • 干扰因素： 溶血（红细胞含DNase II）、脂血、某些药物可能干扰检测结果。高浓度DNA底物、离子强度、pH值、二价阳离子（对DNase I）对酶活测定结果影响显著。
  • 标准化： 不同检测方法、不同实验室间结果可比性需要标准化（如使用国际单位定义活性）。
  • 结果解读： 需结合临床背景、其他实验室检查和临床表现综合判断。目前血清DNase检测在SLE等疾病中更多用于科研或辅助评估，尚未作为常规诊断金标准。
 

总结

脱氧核糖核酸酶检测是一项重要的实验室技术，其方法多样，从基础的琼脂扩散定性试验到精密的荧光定量分析和免疫学检测。它在微生物学鉴定（尤其是细菌）、自身免疫性疾病（特别是SLE）的发病机制研究和潜在标志物探索、以及其他生理病理过程研究中具有重要价值。理解不同检测方法的原理、优缺点以及临床意义，对于正确选择检测项目、合理解读结果至关重要。随着研究的深入，DNase检测在疾病诊断、预后评估和机制探索中的应用前景将更加广阔。