蛋白水解酶活性检测

发布时间：2025-07-04 15:33:08 阅读量：2 作者：生物检测中心

蛋白水解酶活性检测：原理、方法与意义

一、 概述

蛋白水解酶（Proteolytic enzymes 或 Proteases）是催化蛋白质肽键断裂的一类重要酶，广泛存在于生物体内，参与消化、血液凝固、细胞凋亡、免疫反应、组织重塑、信号传导等众多关键的生理和病理过程。准确检测蛋白水解酶的活性对于理解其生物学功能、疾病发生发展机制（如癌症转移、炎症性疾病、神经退行性疾病）、药物靶点发现与验证、以及酶制剂质量控制等领域至关重要。

二、 检测基本原理

蛋白水解酶活性检测的核心在于量化酶催化反应的速度。其通用原理是：

  1. 底物提供： 向酶反应体系中加入特定的蛋白质或多肽底物。
  2. 酶促反应： 在适宜的温度和缓冲条件下，蛋白水解酶作用于底物，将其裂解。
  3. 产物生成： 酶解反应产生新的产物片段。
  4. 产物检测： 利用特定的物理化学方法检测或量化这些产物（或其导致的体系变化）。
  5. 活性计算： 产物生成的速度（通常是单位时间内产物量的增加或底物量的减少）即代表了蛋白水解酶的活性。活性单位通常定义为：在特定条件下（温度、pH），单位时间内催化转化一定量底物所需的酶量（例如，每分钟催化1微摩尔底物水解所需的酶量为1个单位）。
 

三、 主要检测方法

根据检测产物或体系变化方式的不同，常用方法可分为以下几类：

  1. 基于显色底物的方法 (Chromogenic Substrates)：

    • 原理： 使用一端偶联有色发色团（如对硝基苯胺-pNA）的合成小肽作为底物。完整的底物中发色团被“掩蔽”或吸收光谱不同。当酶将发色团从肽链上水解下来时，游离的发色团显现出其特定的颜色（如pNA在405-410 nm波长处呈现黄色）。
    • 检测： 在特定波长（通常是405-410 nm）下，用分光光度计连续监测吸光度（OD值）随时间的升高。
    • 优点： 操作简单直接、快速、灵敏度较高、易于自动化、成本相对较低。
    • 缺点： 通常使用短肽而非天然蛋白质作为底物，无法完全反映酶对天然复杂底物的水解能力；某些发色团溶解度可能有限。
    • 典型应用： 凝血酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、纤溶酶等特异性肽酶活性的检测。

  2. 基于荧光底物的方法 (Fluorogenic Substrates)：

    • 原理： 使用一端偶联荧光基团（如7-氨基-4-甲基香豆素-AMC、荧光素-FITC）和另一端偶联荧光淬灭基团的小肽或修饰蛋白质（如FITC-酪蛋白）作为底物。在完整底物中，荧光信号较弱（淬灭）。酶切作用释放荧光基团或解除淬灭，导致荧光强度显著增强。
    • 检测： 使用荧光分光光度计，在特定激发/发射波长下（如AMC激发360-380 nm，发射440-460 nm；FITC激发485 nm，发射520 nm）连续监测荧光强度随时间的升高。
    • 优点： 灵敏度极高（通常比显色法高1-2个数量级）、选择性好（淬灭基团可提高特异性）、背景干扰小、适用于高通量筛选（HTS）。FITC-酪蛋白等可用于检测对天然蛋白底物的非特异性水解活性。
    • 缺点： 荧光染料可能较昂贵；光漂白效应需要注意；某些复杂蛋白质底物标记荧光后行为可能改变。
    • 典型应用： 广泛用于高灵敏度检测各类蛋白酶活性，特别是激肽释放酶、组织蛋白酶、基质金属蛋白酶（MMPs）、半胱天冬酶（Caspases）、以及使用FITC-酪蛋白等检测广谱蛋白酶活性。

  3. 基于天然蛋白底物的方法：

    • 三氯乙酸（TCA）可溶性产物法 (TCA-soluble Products)：
      • 原理： 使用酪蛋白、血红蛋白、白蛋白等天然蛋白质作为底物。酶解产生的较小肽片段在酸性条件下（加入TCA）可溶，而未被降解的大分子蛋白质底物则沉淀析出。
      • 检测： 离心去除沉淀后，取上清液（含TCA可溶性肽段），用紫外光度计在280 nm波长（主要检测色氨酸、酪氨酸吸收）或Lowry法、BCA法、Folin-酚试剂法（检测肽键或特定氨基酸）测定可溶性产物的含量（吸光度或颜色强度）。
      • 优点： 使用天然底物，更能反映酶的实际水解能力；成本低。
      • 缺点： 操作步骤较多（温育、沉淀、离心、检测），耗时较长；灵敏度相对较低；280 nm检测可能受游离氨基酸干扰。
    • 底物消耗法 / 粘度测定法： 通过测量凝胶状底物（如明胶、胶原）被酶解后体系粘度下降或凝胶液化时间来间接评估蛋白酶活性（如明胶酶谱法）。灵敏度不高，主要用于定性或半定量。
    • SDS-PAGE / 免疫印迹法 (Western Blot)： 将酶解后的蛋白质样品进行电泳分离，通过考马斯亮蓝染色或特异性抗体检测底物蛋白条带的消失或特定酶切片段条带的出现。适用于研究酶对特定底物的切割位点和动力学趋势，但难以精确定量活性。

  4. 放射性同位素标记法：

    • 原理： 使用放射性同位素（如³H, ¹⁴C）标记的天然蛋白质（如³H-酪蛋白或¹⁴C-血红蛋白）作为底物。
    • 检测： 酶解后，加入TCA沉淀未水解的大分子蛋白质，离心后测量上清液中TCA可溶性放射性小肽片段的放射性强度（cpm值）。放射性强度直接反映酶解产物的量。
    • 优点： 灵敏度非常高，尤其是在早期研究中。
    • 缺点： 涉及放射性物质，操作复杂且危险性高，需要特殊防护和废弃物处理，成本高，目前已较少使用，被更安全的荧光等方法取代。

  5. 免疫测定法 (Immunoassays)：

    • 原理： 利用特异性抗体检测酶解特定底物后产生的新生抗原表位（Neoepitope）或特定片段。
    • 检测： 常用ELISA（酶联免疫吸附试验）形式进行定量检测。
    • 优点： 特异性非常高，尤其适用于复杂生物样品（如血清、组织匀浆）中特定蛋白酶活性的检测；可间接反映体内活性。
    • 缺点： 开发特异性识别新生表位的抗体难度大、成本高；通常检测的是累积的酶切产物量而非实时速率；步骤相对繁琐。
    • 典型应用： 临床诊断和研究领域，如检测血清中基质金属蛋白酶（MMPs）降解胶原或明胶产生的特定片段作为生物标志物。
 

四、 方法选择的关键考虑因素

选择最合适的检测方法取决于具体的研究目标和条件：

  1. 酶的特异性： 是检测某种酶的特定活性（需高度特异性底物）还是广谱蛋白酶活性（如使用酪蛋白）？
  2. 灵敏度要求： 样品中酶含量很低时（如细胞裂解液、体液），需选择高灵敏方法（如荧光法、放射法）。
  3. 底物偏好性： 需要评估酶对天然复杂底物还是合成短肽的水解能力？
  4. 检测通量： 是否需要高通量筛选？96孔或384孔板形式的显色/荧光法更适合。
  5. 样品复杂性： 复杂生物样品（如血清）可能含有干扰物质，需选择特异性高或抗干扰能力强的检测方法（如免疫法、特异性荧光底物）。
  6. 仪器设备和成本： 分光光度计更普及，荧光检测仪和配套试剂成本相对较高。
  7. 安全性和便捷性： 放射性方法需要特别注意安全，步骤繁琐。
 

五、 检测流程的一般步骤与注意事项

  1. 样品准备： 提取待测酶（如细胞裂解、组织匀浆、纯化酶液、血清等），确定合适的稀释倍数。保持低温操作以防酶失活。
  2. 缓冲液选择： 选择适合目标酶的最适pH缓冲液（如Tris-HCl、磷酸盐缓冲液等），并含有必要的辅因子（如Ca²⁺对于金属蛋白酶，DTT对于某些半胱氨酸蛋白酶）和稳定剂（如牛血清白蛋白-BSA）。避免使用含氨基的缓冲液（如甘氨酸）干扰某些检测（如Lowry法）。
  3. 底物配制： 根据所选方法配制底物溶液。合成底物通常配制成储存液，使用前稀释至适宜工作浓度；天然底物如酪蛋白需充分溶解（加热助溶后冷却）。
  4. 反应体系建立：
    • 在反应容器（试管或微孔板孔）中预先加入缓冲液和底物溶液，预热至反应温度（通常37°C）。
    • 加入酶液启动反应（注意准确计时）。同时设置：
      • 空白对照： 不含酶的反应体系（通常是酶液用缓冲液代替），用于校正背景信号。
      • 阳性对照： 已知活性的同种酶标准品，用于验证实验体系有效性。
      • 阴性对照： 含有抑制剂的样品或不含底物的体系。
  5. 反应温育： 在恒温（水浴或培养箱）下进行。温育时间需根据酶活性和检测方法预先优化，确保在线性范围内（产物生成量与时间呈正比）。对于连续监测法（如显色、荧光），可直接在分光光度计或荧光计中温育并实时读数。
  6. 反应终止： 对于终点法（如TCA法），需在预定时间点加入终止剂（如TCA、SDS、强酸或强碱、蛋白酶抑制剂）终止反应。
  7. 信号检测： 按所选方法的原理进行吸光度、荧光强度、放射性强度等测量。
  8. 数据处理与活性计算：
    • 扣除空白对照的信号值。
    • 连续监测法： 计算单位时间内吸光度或荧光强度的变化率（ΔA/min 或 ΔRFU/min）。
    • 终点法： 计算反应终止后产生的产物量（根据标准曲线换算）。
    • 根据酶的定义单位和反应体系体积，计算样品中蛋白水解酶的比活性（单位/毫克蛋白）或活性浓度（单位/毫升样品）。
 

注意事项：

  • 线性范围验证： 必须确保反应时间和酶量均在产物生成量与时间/酶量成线性正比的范围内进行检测，这是获得准确活性数据的前提。
  • 温度与pH控制： 酶活性高度依赖温度和pH，必须精确控制并保持一致。
  • 抑制剂与活化剂： 注意样品本身或缓冲液中是否含有待测酶的抑制剂（如EDTA抑制金属蛋白酶，PMSF抑制丝氨酸蛋白酶）或活化剂。
  • 底物浓度： 应使用饱和浓度的底物（远高于酶的Km值），以确保测得的是最大反应速度（Vmax），代表酶的真实活性。
  • 内源性干扰物质： 复杂样品（如血浆）可能含有内源性蛋白酶、酶抑制剂或具有相似信号特性的物质，需通过设置适当对照和优化样品前处理（如稀释、沉淀）来减少干扰。
  • 酶稳定性： 待测酶在实验条件下应保持稳定。冻融次数、储存条件等会影响酶的活性。
  • 重复性： 设置复孔或重复实验，确保结果的可靠性。
 

六、 应用领域

蛋白水解酶活性检测技术广泛应用于：

  • 基础研究： 酶学性质（最适pH、温度、Km、Vmax）、酶动力学分析、酶抑制剂/激活剂筛选、酶在信号通路和生理病理过程中的功能研究。
  • 药物研发： 高通量筛选蛋白酶抑制剂作为候选药物（如抗病毒药物、抗肿瘤药物、抗炎药物）、药物作用机制研究。
  • 临床诊断： 检测血液或其他体液中特定蛋白酶或其降解产物的活性/浓度作为疾病标志物（如肝病、胰腺炎、风湿性关节炎、癌症转移）。
  • 食品工业： 蛋白酶制剂（如用于嫩化肉类、澄清酒类、生产水解蛋白）的质量控制和活性测定。
  • 洗涤剂工业： 评估蛋白酶添加剂的活性与稳定性。
  • 生物技术： 重组蛋白酶的表达与纯化过程中的活性监测。
 

七、 总结

蛋白水解酶活性检测是生物医学研究和应用中的一项核心技术。从传统的显色底物法、基于天然底物的TCA法，到高灵敏度的荧光法和特异性强的免疫法，多种检测方法各具特点和适用场景。研究者需根据目标酶的特性、样品类型、灵敏度需求、通量以及现有设备条件，谨慎选择最适宜的方法。严格优化实验条件（pH、温度、反应时间、底物浓度），并充分考虑干扰因素和设置合理的对照，是获得准确、可靠、可重复的蛋白水解酶活性数据的关键。这些数据对于深入理解蛋白酶的生物学作用、疾病机制、开发诊断方法和治疗药物具有重要意义。