溶菌酶活性检测

发布时间：2025-07-04 15:28:41 阅读量：3 作者：生物检测中心

溶菌酶活性检测完整方法（浊度法）

一、 检测原理

溶菌酶（Lysozyme， EC 3.2.1.17）是一种广泛存在于生物体液（如泪液、唾液、乳汁）和细胞（如中性粒细胞）中的碱性水解酶。其核心功能是催化某些革兰氏阳性菌（如溶壁微球菌，Micrococcus lysodeikticus）细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺残基之间的β-1,4-糖苷键水解，导致细胞壁破裂，细菌溶解。

浊度法（Turbidimetric Assay）是检测溶菌酶活性的经典方法。其原理基于：

  1. 底物悬液： 将溶壁微球菌制成均匀的悬浮液，其浊度（光密度OD值）与细菌浓度成正比。
  2. 酶促反应： 当加入溶菌酶后，溶菌酶水解细菌细胞壁，导致细菌裂解。
  3. 浊度下降： 细菌裂解后，悬液中完整细菌颗粒减少，悬液变得澄清，浊度（OD值）下降。
  4. 活性关联： 在一定浓度和时间范围内，浊度下降的速率（ΔOD/min）与溶菌酶的活性成正比。
 

二、 所需试剂与材料

  1. 底物： 溶壁微球菌 (Micrococcus lysodeikticus) 冻干粉。
  2. 酶标准品： 鸡蛋清溶菌酶冻干粉（已知纯度）。
  3. 缓冲液： 磷酸钾缓冲液 (0.1 M, pH 6.24 ± 0.02)。
    • 称取磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 16.36 g和磷酸氢二钾(K₂HPO₄) 0.52 g，溶解于约900 mL蒸馏水中。
    • 用精密pH计调节pH值至6.24±0.02（25℃）。
    • 定容至1000 mL。4℃贮存。
  4. 反应终止液： 氢氧化钠溶液 (1%, w/v)。
    • 称取1.0 g氢氧化钠(NaOH)，溶解于100 mL蒸馏水中。
  5. 样品： 待测溶菌酶溶液（如血清、泪液、唾液、酶提取物等）。样品需用磷酸钾缓冲液进行适当稀释，使其活性落在标准曲线线性范围内。
  6. 其他：
    • 紫外-可见分光光度计（带恒温比色架）
    • 石英比色皿（光程1cm）
    • 恒温水浴锅（25℃）
    • 精密计时器
    • 分析天平
    • 磁力搅拌器
    • 移液枪及配套枪头
    • 容量瓶、烧杯、玻璃棒等
 

三、 仪器

  1. 紫外-可见分光光度计（波长范围包含450nm）
  2. 恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
  3. 分析天平（精度0.1mg）
  4. 磁力搅拌器
  5. 精密计时器（秒级精度）
 

四、 操作步骤

（一）试剂配制

  1. 磷酸钾缓冲液 (0.1 M, pH 6.24)： 按第二部分第3点配制，使用前恢复至25℃。
  2. 底物悬液 (OD₄₅₀ₙₘ ≈ 0.6-0.8)：
    • 准确称取适量溶壁微球菌冻干粉（通常约10-15 mg）。
    • 加入约50 mL预冷的磷酸钾缓冲液。
    • 置于磁力搅拌器上，在4℃（冰浴）或室温下剧烈搅拌30分钟（避免起泡），使细菌均匀分散。避免过热。
    • 将悬液转移至100 mL容量瓶中，用磷酸钾缓冲液洗涤烧杯数次，洗液并入容量瓶。
    • 用磷酸钾缓冲液定容至100 mL。
    • 立即测定其在450 nm波长下，以磷酸钾缓冲液为参比的OD值（ODₛ）。
    • 调整： 若ODₛ不在0.6-0.8范围内，需重新配制底物悬液，调整溶壁微球菌粉末用量直至ODₛ达标。临用前配制。
  3. 溶菌酶标准溶液：
    • 母液(1 mg/mL)： 准确称取约10 mg已知纯度的鸡蛋清溶菌酶冻干粉，溶解于磷酸钾缓冲液中，定容至10 mL容量瓶。4℃可短期保存（≤48小时）。
    • 工作液： 用磷酸钾缓冲液将母液稀释成一系列浓度（通常为0, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL）。临用前配制。
 

（二）标准曲线测定

  1. 预热： 开启分光光度计，设定波长为450 nm。预热至少30分钟。开启恒温水浴锅，设定温度为25℃，待温度稳定。
  2. 准备比色皿： 取数支干净的1cm光程石英比色皿。
  3. 加样（按以下顺序快速操作）：
    • 向一支比色皿中加入2.90 mL预热的（25℃）磷酸钾缓冲液，作为空白对照。
    • 向另一支比色皿中加入2.90 mL预热的（25℃）底物悬液，立即混匀（此管为反应时间0点的OD值）。
    • 取一支新比色皿，加入2.80 mL预热（25℃）的底物悬液。
    • 加入0.10 mL相应浓度的溶菌酶标准工作液（例如0 μg/mL），立即用移液枪吹打混匀3-5次（勿产生气泡），同时启动计时器。
    • 反应终止： 准确反应2分钟（±3秒）时，立即加入1.0 mL 终止液（1% NaOH），迅速混匀以终止反应。
  4. 测定OD： 将终止后的反应液倒入比色皿中（避免气泡），以步骤3中“2.90 mL缓冲液”的比色皿为空白（调零），在450 nm波长下测定其OD值（ODₜₑₛₜ）。
  5. “0分钟”对照： 将步骤3中“2.90 mL底物悬液”的比色皿（代表反应时间为0）也加入1.0 mL 1% NaOH终止液，混匀。以缓冲液空白调零后，测定其OD值（OD₀）。
  6. 重复： 对其余浓度的标准溶液（5, 10, 20...100 μg/mL），重复步骤3c至步骤5。每个浓度建议做平行样品（n=2或3）。
  7. 计算ΔOD： 计算每个测定的溶菌酶浓度对应的浊度下降值：ΔOD = OD₀ - ODₜₑₛₜ
    • 注意：OD₀应为同一个批次配制的底物悬液测得的平均值。
 

（三）样品测定

  1. 样品准备： 根据预估的溶菌酶活性，用磷酸钾缓冲液对样品进行适当稀释（使稀释后样品的活性在标准曲线线性范围内，通常ΔOD在0.05-0.3之间）。
  2. 测定： 将步骤（二）中的“溶菌酶标准工作液”替换为0.10 mL稀释后的待测样品溶液，重复步骤（二）中的3c至5操作。每个样品也需做平行测定（n=2或3）。
  3. 计算ΔOD： 同样计算每一个样品测定管的浊度下降值：ΔODₛₐₘₚₗₑ = OD₀ - ODₜₑₛₜ（样品管）
 

五、 结果计算

  1. 绘制标准曲线：
    • 以溶菌酶标准溶液的浓度为横坐标（X，μg/mL），以其对应的平均ΔOD值为纵坐标（Y）。
    • 利用线性回归拟合得到标准曲线方程：ΔOD = k × C + b
    • 其中：k 为斜率（单位：ΔOD·mL/μg），C 为溶菌酶浓度（μg/mL），b 为截距。
    • 理想情况下，截距b应接近0（表示0浓度时无变化），相关系数（R²）应 ≥ 0.99。
  2. 计算样品溶菌酶浓度：
    • 将测得的样品ΔODₛₐₘₚₗₑ值代入标准曲线方程。
    • 计算稀释后样品中溶菌酶的浓度（Cₛₐₘₚₗₑ）：Cₛₐₘₚₗₑ (μg/mL) = (ΔODₛₐₘₚₗₑ - b) / k
  3. 计算原始样品活性/浓度：
    • 根据样品的稀释倍数（D），计算原始样品中的溶菌酶浓度：
      原始浓度 (μg/mL) = Cₛₐₘₚₗₑ × D
  4. 活性单位定义（可选）：
    • 一个常用的溶菌酶活力单位（U）定义为：在25℃，pH 6.24条件下，每分钟能使450 nm处浊度（OD值）下降0.001的酶量。
    • 计算活力单位：活性 (U/mL) = (ΔODₛₐₘₚₗₑ / 0.001) × (1000 / 反应时间(min)) × (1 / 样品体积(mL)) × D
      • 反应时间为2 min。
      • 样品体积为0.10 mL。
      • 代入公式简化为：活性 (U/mL) = (ΔODₛₐₘₚₗₑ × 5, 000, 000) × D
 

六、 注意事项

  1. 温度控制： 反应温度（25℃）必须严格控制且恒定，温度波动会显著影响酶活性。所有试剂、底物悬液、样品稀释液、比色皿均需预先平衡至25℃再进行操作。
  2. 时间控制： 酶反应的2分钟时间必须精确控制（误差<±3秒），计时器的启动与终止液的加入应同步进行。此步骤对结果重现性至关重要。
  3. 底物悬液质量：
    • OD₄₅₀ₙₘ必须严格控制在0.6-0.8之间以保证线性范围和灵敏度。
    • 剧烈搅拌分散均匀是关键，避免结块。
    • 必须临用前新鲜配制，放置过久细菌会沉降或自溶。搅拌后立即使用。
  4. 操作一致性： 加样顺序、混匀方式（力度、次数）应力求一致，特别是启动反应加入酶液时的操作要迅速、标准。
  5. 样品稀释： 确保待测样品稀释后的ΔOD值落在标准曲线的线性范围内（通常在0.05-0.3）。超出范围需调整稀释倍数重测。
  6. 平行测定： 标准品和样品均应进行平行测定（n≥2），取平均值计算结果。
  7. 仪器： 分光光度计需预热稳定，比色皿必须洁净透明无水渍污渍。
  8. 安全：
    • 操作微生物（溶壁微球菌）需遵循生物安全一级（BSL-1）规范。
    • 处理氢氧化钠溶液时佩戴手套和护目镜。
  9. 质量控制：
    • 每次实验必须包含标准曲线。
    • 可考虑引入已知浓度或活性的质控品进行监控。
    • 平行样结果相对标准偏差（RSD%）应小于5%。
  10. 缓冲液pH： pH值必须精确为6.24±0.02，pH偏差会影响酶活性。
  11. 终止反应： 氢氧化钠终止液必须足量（1mL）并彻底混匀，确保酶活性完全终止。
 

七、 方法评价与替代方法

  • 优点： 浊度法操作相对简便、快速、灵敏度较高、成本较低，是实验室常用的标准方法。
  • 缺点： 结果受底物悬液均匀度、浊度稳定性、操作时间精确性等因素影响较大。线性范围相对较窄。
  • 替代方法：
    • 平板扩散法： 在含有溶壁微球菌的琼脂平板上打孔，加入样品溶液，孵育后测量透明圈直径。适用于半定量或样品数量多但精度要求不高的情况。
    • 荧光底物法： 使用荧光标记的溶菌酶特异底物（如M. lysodeikticus FITC标记细胞壁片段），酶解后释放荧光物质，检测荧光强度变化。灵敏度高，干扰少，自动化程度高，但试剂成本高。
    • 免疫学法（ELISA）： 利用溶菌酶特异抗体进行检测。特异度高，适用于复杂基质（如血清）中溶菌酶含量的精确测定，但测定的是抗原量而非酶活性。
 

浊度法因其经典性与实用性，仍然是评估溶菌酶活性的首选方法之一。严格遵循操作规程和质量控制措施是获得准确可靠结果的关键。

本文提供的方法基于广泛接受的浊度法原理和操作实践撰写，内容完整、独立，不涉及任何特定厂商或商品信息，适用于科研、教学与标准化检测流程参考。实验人员应结合具体实验室条件优化细节。