激酶活性检测

发布时间：2025-07-04 15:17:21 阅读量：2 作者：生物检测中心

激酶活性检测：原理、方法与应用

激酶是催化蛋白质、脂质或核苷酸等底物磷酸化的一类关键酶，通过添加磷酸基团调控细胞信号转导、代谢、增殖、凋亡等核心生命活动。其活性异常与癌症、神经退行性疾病、炎症及代谢紊乱等多种病理状态密切相关。因此，精确检测激酶活性对于基础生物学研究、疾病机制探索及药物开发（尤其是激酶抑制剂筛选）至关重要。

一、检测原理的核心

激酶活性检测的本质是测量激酶在单位时间内催化底物磷酸化反应的程度。其通用反应式为：

激酶
底物 + ATP → 磷酸化底物 + ADP + H⁺

检测策略主要围绕监测以下变化之一或组合：

  1. 磷酸化底物的生成量： 最直接的方式（如放射性标记、抗体检测）。
  2. ATP的消耗量： 反映总反应进程（如荧光素酶法、磷酸盐检测法）。
  3. ADP的生成量： 与ATP消耗相对应（如多种偶联酶法）。
  4. 磷酸基团的释放： 部分方法检测无机磷酸盐（Pi）的释放（如钼蓝法）。
 

二、主流检测方法详解

根据检测信号类型，主要分为以下几类：

  1. 放射性标记法

    • 原理： 使用放射性同位素（通常为 γ-³²P 或 γ-³³P）标记的 ATP（[γ-³²P]-ATP）作为磷酸供体。反应后，通过洗涤去除游离的放射性ATP，检测与底物结合的放射性磷酸基团。
    • 检测方式：
      • 滤膜结合法： 利用磷酸化蛋白/肽段结合于特定滤膜（如磷酸纤维素膜、PVDF膜）。
      • 液相分离（如TCA沉淀）： 使磷酸化蛋白沉淀，洗涤后测量沉淀物放射性。
      • 凝胶电泳结合放射自显影/磷屏成像： 分离底物后检测磷酸化条带。
    • 优点： 灵敏度极高（可达皮摩尔级），被视为“金标准”，适用于复杂体系（如细胞裂解液）。
    • 缺点： 放射性危害，操作繁琐耗时，废物处理成本高，不适合高通量筛选（HTS）。

  2. 基于抗体的检测法

    • 原理： 利用高度特异性的抗体识别磷酸化底物上的特定磷酸化位点。
    • 常用技术：
      • 酶联免疫吸附试验(ELISA/EIA)： 将底物（通常是特异性肽段）包被在微孔板上，反应后加入抗磷酸化特异性的抗体（一抗），再通过酶标二抗（如HRP标记）催化显色底物产生信号（吸光度或化学发光）。
      • 免疫印迹(Western Blot)： 反应后样本进行SDS-PAGE电泳分离，转膜，用抗磷酸化特异性的抗体检测目标磷酸化蛋白条带（显色或化学发光）。
      • Alpha技术： 利用供体微珠和受体微珠在激光激发下近距离产生放大的发光信号。激酶的磷酸化反应促使供受体微珠靠近。
    • 优点： 特异性高（识别特定磷酸化位点），适用于复杂样本，ELISA和Alpha技术可中高通量。
    • 缺点： 依赖高质量抗体，抗体成本可能较高，步骤相对较多（尤其WB），可能存在交叉反应风险。

  3. 荧光检测法

    • 原理： 利用荧光信号的强度、偏振、能量转移等变化来指示反应。
    • 主要类型：
      • 荧光偏振(FP)/各向异性(FI)： 游离的小分子荧光标记肽段旋转快，偏振值低；磷酸化后被特异的抗磷酸化抗体结合形成大复合物，旋转减慢，偏振值升高。信号升高与激酶活性正相关。
      • 荧光共振能量转移(FRET)： 设计含有磷酸化位点的肽段，两端标记供体荧光基团和受体淬灭基团/荧光基团。未磷酸化时，二者靠近，发生淬灭/FRET；磷酸化后被识别结构域（如磷酸化结合域）结合导致构象改变，使供受体分离，淬灭/FRET效应减弱或消失，供体荧光恢复/增强。信号变化与激酶活性相关。
      • 时间分辨荧光能量转移(TR-FRET)： 结合了时间分辨荧光（减少背景干扰）和FRET原理。常用稀土元素螯合物（如铕）作为供体，合适的受体（如APC, d2）。原理与FRET类似，检测效率更高，背景更低。
      • 荧光生成/淬灭法： 有些底物设计为磷酸化后荧光基团被水解或构象改变而释放荧光（生成法）；或被淬灭（淬灭法）。
    • 优点： 灵敏度高，均相检测（无需分离步骤，操作简便），非常适合高通量筛选(HTS)，试剂消耗少。
    • 缺点： 可能受化合物自发荧光或淬灭干扰（需进行干扰测试），部分方法开发成本可能较高。

  4. 比色检测法

    • 原理： 检测反应产生的有色产物。
    • 主要类型：
      • 偶联酶法（检测ADP生成）： 激酶反应生成的ADP被丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)偶联消耗NADH。NADH在340nm有强吸收，其消耗量（吸光度下降）与ADP生成量（即激酶活性）成正比。
      • 磷酸盐检测法（检测Pi释放）： 激酶反应释放的无机磷酸盐(Pi)可与钼酸盐、孔雀石绿等试剂反应生成有色复合物进行检测（如钼蓝法）。
    • 优点： 仪器要求低（普通酶标仪即可），成本相对较低，操作相对简单。
    • 缺点： 灵敏度通常低于荧光和发光法，Pi释放法对体系中游离Pi敏感（需严格控制背景），ADP检测法需要额外添加多种酶和辅因子。
 

三、实验设计与关键考量

  1. 体系组分优化：

    • 缓冲液： 选择合适pH和缓冲体系（如Tris-HCl, HEPES）。Mg²⁺（或Mn²⁺）是大多数激酶必需的辅助因子。常添加DTT或β-巯基乙醇防止氧化。可加入BSA稳定蛋白。
    • ATP浓度： 需优化至接近该激酶的Km(ATP)，通常在1-100 μM范围内。浓度过高会掩盖抑制剂的效应；过低则反应速率过低。
    • 底物： 选择生理相关底物（蛋白、肽段或人工合成肽）。肽段底物需包含磷酸化位点及其周围的序列。浓度应在Km附近优化（通常在5-50 μM）。
    • 酶浓度： 应使反应速率在线性范围内（底物消耗<20%），通常通过预实验确定。
    • 反应时间： 确保在反应速率线性期内终止反应。

  2. 对照设置：

    • 阳性对照： 不加入抑制剂时的最大活性孔。
    • 阴性对照： 不含激酶（空白）或加入饱和浓度已知有效抑制剂的孔（完全抑制）。
    • 背景对照： 不含底物的反应孔或仅含检测试剂的孔（用于校正检测系统本身信号）。
    • 溶剂对照： 加入与抑制剂等体积的溶剂（如DMSO），用于校正溶剂对反应的潜在影响（尤其在高浓度DMSO时）。

  3. 反应起始与终止：

    • 起始： 通常在加入ATP（或含ATP的混合物）时开始计时。预孵育除ATP外的所有组分可减少起始误差。
    • 终止： 方法取决于检测原理：
      • 放射性/抗体法：加入强变性剂（如SDS, EDTA），或立即置于冰上。
      • ADP检测法：检测的是反应过程中ADP的积累速率，常为连续监测。
      • 均相荧光/发光法：反应通常在设计好的检测缓冲液中进行，无需物理终止，直接读数。
 

四、数据解读与注意事项

  1. 信号转化： 原始信号（吸光度、荧光强度、发光值、CPM等）需扣除背景（通常是空白对照均值），并转化为反映活性的指标：

    • 相对活性： 相对于阳性对照（最大活性，定义为100%）的百分比。
    • 产物生成量： 根据标准曲线计算磷酸化底物、ADP或Pi的摩尔浓度。
    • 反应速率： 产物生成量（或信号变化量）除以反应时间（通常用nmol/min/mg酶表示比活力）。

  2. 动力学参数测定（深入研究）：

    • 米氏常数(Km)： 固定酶浓度，改变底物浓度[S]，测量初速率V。用双倒数图或非线性拟合软件（如GraphPad Prism）求得Km（反映底物亲和力）和Vmax（最大反应速率）。
    • 抑制剂常数(Ki)/半数抑制浓度(IC50)： 在固定底物浓度下，加入不同浓度抑制剂，测量残余活性。拟合剂量反应曲线得到IC50。需注意IC50受底物浓度影响（竞争性抑制剂尤为明显），通过不同底物浓度下的IC50值可进一步计算Ki（真实抑制常数）。

  3. 干扰评估（尤其药物筛选）：

    • 化合物干扰： 测试化合物可能直接抑制检测系统中的酶（如偶联酶法中的PK/LDH）、淬灭荧光、吸收光或自发发光。需设计不含靶激酶但包含检测系统的对照孔来评估这种干扰。
    • 聚集假阳性： 某些化合物在较高浓度下会形成胶体聚集体，非特异性地吸附蛋白（包括激酶）导致假阳性抑制。可通过加入清洁剂（如Triton X-100）或检测化合物在无酶体系中的信号是否异常来判断。
 

五、前沿技术与展望

  1. 无标记技术：

    • 表面等离子体共振(SPR)： 实时监测激酶与固定在芯片上的底物结合以及磷酸化反应引起的质量变化。
    • 微量热泳动(MST)： 检测磷酸化导致蛋白分子大小或电荷改变引起的热泳动迁移率变化。
    • 生物膜干涉(BLI)： 类似SPR，利用光干涉原理监测生物分子在传感器表面的结合和解离。
    • 优点： 无需标记，可实时监测动力学。局限： 仪器昂贵，通量相对较低。

  2. 细胞水平激酶活性检测：

    • 细胞裂解液检测： 提取细胞总蛋白或特定组分（如免疫沉淀激酶），体外测定活性（常用前述方法）。
    • 基于抗体的胞内磷酸化流式细胞术： 固定和透化细胞，用荧光标记的磷酸化特异抗体染色，通过流式细胞仪定量单细胞水平的激酶靶标磷酸化状态。
    • 基于抗体的胞内磷酸化成像： 免疫荧光/免疫组化观察组织或细胞中磷酸化靶标的定位和丰度。
    • 荧光/发光报告基因系统： 构建含有激酶反应元件（转录因子结合位点）调控的报告基因（如荧光素酶、GFP）的细胞系，激酶激活下游通路导致报告基因表达。
    • 优点： 在更接近生理的细胞内环境中评估激酶通路活性。

  3. 质谱分析：

    • 磷酸化蛋白质组学： 大规模鉴定和定量复杂样本中蛋白质的磷酸化位点及其修饰程度，间接反映激酶活性网络。常用策略包括磷酸化肽段富集（TiO2, IMAC）结合LC-MS/MS。
    • 靶向质谱（如SRM/MRM）： 高灵敏度、高特异性定量特定磷酸化肽段的丰度。
    • 优点： 覆盖范围广，无偏好性，可发现新的磷酸化位点和调控事件。局限： 操作复杂，成本高，定量精度和动态范围有时受限。
 

结论：

激酶活性检测技术不断发展，从经典的放射性方法到如今高通量、均相、高灵敏的荧光/发光平台，再到无标记技术和细胞原位检测方法，为研究者提供了多样化的选择。选择合适的方法需综合考虑研究目的（基础机制vs药物筛选）、样本类型（纯化酶vs细胞裂解液vs活细胞）、所需灵敏度、特异性、通量以及成本预算等因素。深刻理解每种方法的原理、优势和局限性，精心设计实验方案并严格设置对照，是获得可靠、可重复数据的关键。随着技术的持续创新，尤其是细胞原位实时监测和超高灵敏度检测的发展，我们将能更精准、更全面地描绘激酶在生理和病理过程中的动态调控图谱，加速疾病机制研究和靶向药物开发进程。