蛋白酶活性检测

发布时间：2025-07-04 14:57:15 阅读量：2 作者：生物检测中心

蛋白酶活性检测：原理、方法与操作指南

摘要： 蛋白酶是催化蛋白质肽键水解的一类重要酶，广泛存在于生物体并应用于工业、医药及科研领域。准确测定蛋白酶活性对酶学研究、工艺优化及质量控制至关重要。本文系统阐述蛋白酶活性检测的原理、常用方法、详细操作步骤、结果计算及注意事项，提供标准化的技术参考。

一、 检测原理

蛋白酶活性检测的核心原理是定量测定蛋白酶在特定条件下（温度、pH、时间）催化特定蛋白质底物水解的速率。常用方法基于以下两类信号变化：

  1. 底物消耗/产物生成检测：
    • 比色法： 利用水解产物（如酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸）与特定试剂（如Folin-酚试剂）反应产生有色化合物，其吸光度与产物量（即酶活性）成正比。常用底物为酪蛋白、血红蛋白等。
    • 荧光法： 使用标记了荧光基团（如AMC, AFC）或发生荧光共振能量转移（FRET）的合成多肽底物。酶水解导致荧光基团释放或FRET效应消失，荧光强度增强，其变化速率反映酶活性。
    • 紫外分光光度法： 直接检测水解产物（如酪氨酸）在特定波长（如275 nm）处的紫外吸收增加。
  2. 物理性质变化检测：
    • 浊度法/凝乳法： 适用于凝乳酶等特定蛋白酶。酶水解酪蛋白导致溶液浊度下降或形成凝块，通过测定浊度变化或凝块形成时间推算活性。
    • 粘度法： 酶解高分子量底物（如明胶）导致溶液粘度下降，可通过粘度计测量。
 

二、 常用检测方法详解（以酪蛋白-Folin酚比色法为例）

该方法因其灵敏度和通用性被广泛采用。

  1. 试剂与材料：

    • 底物溶液： 准确称取酪蛋白，溶解于适宜的缓冲液（如0.1 M Tris-HCl, pH 7.5 或 0.1 M 磷酸盐缓冲液，pH 7.0），加热助溶后冷却，调整至所需浓度（如0.5-2% w/v）。需新鲜配制或分装冻存。
    • 三氯乙酸溶液： 终止反应用（如5% w/v）。
    • Folin-酚试剂： 市售标准试剂，按说明书稀释（如1:1或1:2稀释）。避光保存。
    • 碳酸钠溶液： 显色反应用（如0.4 M）。
    • 标准溶液： L-酪氨酸标准溶液（如100 μg/mL），用于制作标准曲线。
    • 缓冲液： 与底物溶液匹配的缓冲液（如0.1 M Tris-HCl, pH 7.5）。
    • 待测酶液： 用缓冲液适当稀释，使测得的吸光度在标准曲线线性范围内。
    • 仪器： 分光光度计、恒温水浴锅、离心机、计时器、移液器、试管/比色皿。

  2. 操作步骤：

    • 步骤 1：预热 将底物溶液和缓冲液置于恒温水浴锅中预热至反应温度（如37°C）。
    • 步骤 2：反应启动 取一支试管，加入预热好的底物溶液（如1.0 mL）和预热好的缓冲液（如0.5 mL）。加入适量稀释酶液（如0.5 mL），立即混匀并开始计时。（此管为反应管）
    • 步骤 3：反应终止 精确反应一定时间（如10分钟）后，立即加入预冷的TCA溶液（如2.0 mL）终止反应，充分混匀。
    • 步骤 4：空白对照 另取一支试管，先加入TCA溶液（如2.0 mL），再加入底物溶液（1.0 mL）和酶液（0.5 mL），混匀。（此管为空白管，消除非酶水解及试剂本底）
    • 步骤 5：沉淀与离心 将反应管和空白管静置（如室温10分钟）使未水解的蛋白质沉淀完全，然后在适当转速下离心（如3000-4000 g，10分钟）。
    • 步骤 6：取上清液 小心吸取上清液（避免吸入沉淀）。
    • 步骤 7：显色反应 取适量上清液（如1.0 mL）加入另一支洁净试管，加入碳酸钠溶液（如2.5 mL），混匀。再加入稀释的Folin-酚试剂（如0.5 mL），立即充分混匀。
    • 步骤 8：显色与测定 将试管避光静置（如室温30分钟或40°C水浴10分钟）。在分光光度计上，以水或空白管（按同样步骤处理，但不含酪氨酸）调零，于650 nm（或660 nm/750 nm）波长处测定反应管显色液的吸光度（A<sub>样品</sub>）。
    • 步骤 9：标准曲线制作 取不同体积的酪氨酸标准溶液（如0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mL），用缓冲液补足至1.0 mL（相当于含酪氨酸0, 20, 40, 60, 80, 100 μg）。按步骤7和8进行显色和测定吸光度（A<sub>标准</sub>）。以酪氨酸含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

  3. 结果计算：

    • 根据测得的A<sub>样品</sub>，从酪氨酸标准曲线上查得对应的酪氨酸生成量（微克，μg）。
    • 蛋白酶活性单位定义： 通常定义为在特定反应条件下（温度、pH、时间），每分钟水解底物产生1 μg酪氨酸所需的酶量定义为一个活性单位（U）。
    • 酶活性计算：
      • 每分钟产生的酪氨酸量（μg/min） = (查得酪氨酸量(μg)) / 反应时间(min)
      • 酶活性（U/mL） = [每分钟产生的酪氨酸量(μg/min) * 反应液总体积(mL) * 酶液稀释倍数] / [加入酶液体积(mL) * 1]
      • 简化公式： 酶活性 (U/mL) = (A<sub>样品</sub>对应的酪氨酸μg数 * 反应液总体积 * 稀释倍数) / (反应时间(min) * 加入酶液体积(mL) * 1)

  4. 注意事项：

    • 温度控制： 预热充分，反应温度需精确恒定。
    • 时间控制： 加酶启动和加TCA终止反应的操作要迅速准确，确保反应时间一致。
    • 底物浓度： 应过量，确保反应初速度为0级动力学（吸光度变化在反应时间内呈良好线性）。
    • 酶液浓度： 稀释倍数需调整，使A<sub>样品</sub>落在标准曲线线性范围内（通常A值在0.1-0.8之间）。
    • pH值： 缓冲液pH需严格校准，对酶活性影响极大。
    • 试剂质量： 酪蛋白纯度、Folin-酚试剂有效期、TCA浓度等需保证。
    • 离心效果： 确保沉淀完全且离心后上清液澄清，否则影响显色和吸光度测定。
    • 显色条件： Folin-酚反应对时间、温度敏感，需保持一致。加Folin-酚后需立即混匀。
    • 标准曲线： 每次检测（尤其更换试剂批次时）需重新制作标准曲线。
    • 安全防护： 浓碱（碳酸钠）、浓酸（TCA）、Folin-酚试剂均有腐蚀性或刺激性，操作时佩戴手套、护目镜，在通风处进行。
 

三、 其他方法简述

  • 荧光底物法： 使用合成多肽底物（如Suc-AAPF-AMC）。加入酶液启动反应，在荧光分光光度计上连续监测特定激发/发射波长（如Ex 380 nm / Em 460 nm）下荧光强度的上升速率（RFU/min）。活性单位常定义为每分钟水解1 μmol底物（或产生1 μmol荧光产物）所需的酶量。灵敏度高，特异性强，适用于高通量筛选。
  • 紫外分光光度法： 直接检测275 nm处吸光度增加（ΔA<sub>275</sub>/min）。操作相对简单，但灵敏度较低，易受其他紫外吸收物质干扰。
  • 凝乳法： 主要用于凝乳酶活性测定（如测定牛奶凝结时间）。将酶液加入预热牛奶中，记录从加酶到出现肉眼可见凝块所需时间（凝乳时间）。活性单位（如IMCU）可通过标准曲线或公式换算得到。
 

四、 方法选择与应用

  • 基础研究与酶学性质表征： Folin-酚比色法、荧光底物法、紫外分光光度法均可提供定量数据，FolIn-酚法成本较低通用性强，荧光法灵敏度高动力学范围宽。
  • 工业生产过程监控与质量控制： 需考虑速度、成本、通量和重现性。Folin-酚法仍是常用标准方法。荧光法适用于自动化高通量检测。
  • 特定蛋白酶检测（如凝乳酶）： 需使用凝乳法等特异性方法。
  • 临床诊断： 常使用高度特异性的合成底物荧光法或免疫学方法。
 

五、 结论

蛋白酶活性检测是评估蛋白酶功能和应用价值的关键技术。选择合适的检测方法需综合考虑检测目的（基础研究、质量控制、临床诊断）、酶的特性、所需灵敏度、特异性、通量及成本等因素。酪蛋白-Folin酚比色法作为经典方法，因其原理清晰、操作相对简便、成本较低且结果可靠，在科研和工业领域仍被广泛应用。荧光底物法则在高灵敏度、高特异性和自动化检测方面具有显著优势。严格遵守标准操作流程（SOP）、精确控制反应条件（温度、pH、时间）以及规范的结果计算是确保检测数据准确可靠的核心要素。