胆管结扎诱导炎症因子(大鼠/小鼠)检测

发布时间：2025-07-04 13:53:34 阅读量：3 作者：生物检测中心

以下为完整的胆管结扎（Bile Duct Ligation, BDL）诱导动物模型炎症因子检测实验方案，严格避免任何企业名称，适用于大鼠或小鼠模型：

胆管结扎诱导肝损伤模型的炎症因子检测实验方案

一、实验目的

通过胆管结扎术诱导胆汁淤积性肝损伤，检测肝脏及血清中关键炎症因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6等）的表达水平，评估肝内炎症反应程度。

二、实验材料

  1. 实验动物

    • 健康雄性Sprague-Dawley大鼠（推荐）或C57BL/6小鼠
    • 体重：大鼠200–250g，小鼠20–25g
    • 分组：假手术组（Sham）、胆管结扎组（BDL），每组≥6只。

  2. 主要试剂

    • 麻醉剂（如戊巴比妥钠）
    • 生理盐水、肝素抗凝管
    • 多聚甲醛（4%，组织固定）
    • RNA提取试剂、反转录试剂、荧光定量PCR试剂
    • 蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂
    • ELISA检测试剂盒（目标因子：TNF-α, IL-1β, IL-6等）
    • 抗体：目标炎症因子一抗/二抗（WB/IHC用）

  3. 仪器设备

    • 手术器械（显微镊、剪、持针器）、6-0缝合线
    • 离心机、低温高速离心机
    • 实时荧光定量PCR仪
    • 酶标仪、电泳系统、转膜仪
    • 显微镜（光学/荧光）
    • 组织匀浆器
 

三、实验流程

1. 胆管结扎手术
  • 麻醉：腹腔注射戊巴比妥钠（大鼠45mg/kg；小鼠50mg/kg）。
  • 操作步骤：
    1. 腹中线切口（大鼠约3cm，小鼠约1.5cm），暴露胆总管。
    2. 双线结扎胆总管中段（间距约5mm），中间剪断（确保完全梗阻）。
    3. 假手术组：仅分离胆管不结扎。
    4. 逐层缝合腹腔，碘伏消毒皮肤。
  • 术后护理：
    • 单独笼养，保暖至苏醒。
    • 自由饮水，术后12小时恢复喂食。
    • 监测体重及生存状态（BDL组存活率：大鼠>7天，小鼠>5天）。
 
2. 样本收集（术后7天）
  • 血清制备：
    1. 麻醉动物，腹主动脉采血，静置30分钟后离心（4℃, 3000rpm, 15min）。
    2. 吸取上清（血清），-80℃保存。
  • 肝脏组织处理：
    1. 取肝左叶分装：
      • 冷冻样本：液氮速冻，-80℃保存（用于RNA/蛋白提取）。
      • 固定样本：4%多聚甲醛固定24小时→石蜡包埋（用于IHC）。
 
3. 炎症因子检测
(1) 血清ELISA检测
  • 步骤：
    1. 按试剂盒说明书稀释血清（通常1:2~1:10）。
    2. 加入96孔板，孵育标准品/样本。
    3. 洗涤后加生物素化抗体→酶标二抗→显色剂。
    4. 酶标仪读取450nm吸光度，计算浓度（pg/mL）。
  • 目标因子：TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, IFN-γ等。
 
(2) 组织mRNA水平检测（qRT-PCR）
  • RNA提取：
    • 取50mg肝组织，裂解液匀浆→氯仿抽提→异丙醇沉淀。
    • 测定纯度（A260/A280≈1.8–2.0）。
  • 反转录：
    • 1μg RNA反转录为cDNA（20μL体系）。
  • qPCR扩增：
    • 引物设计（示例）：
  
 
MarkDown
 
TNF-α Forward: 5'-ATGAGCACAGAAAGCATGATC-3' TNF-α Reverse: 5'-TACAGGCTTGTCACTCGAATT-3' GAPDH Forward: 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' GAPDH Reverse: 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'
  • 反应条件：95℃预变性5min；40循环（95℃ 15s→60℃ 30s）。
  • 数据分析：2<sup>−ΔΔCt</sup>法计算基因相对表达量。
 
(3) 组织蛋白水平检测
  • Western Blot：
    1. 裂解肝组织提取总蛋白，BCA法定量。
    2. 上样30μg蛋白，SDS-PAGE电泳→转膜→5%脱脂牛奶封闭。
    3. 一抗（抗TNF-α/IL-1β等，1:1000）4℃孵育过夜。
    4. HRP标记二抗（1:5000）室温孵育1h。
    5. ECL显影，ImageJ分析条带灰度值。
  • 免疫组化（IHC）：
    • 石蜡切片脱蜡→抗原修复→3% H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>阻断→一抗孵育→DAB显色→苏木素复染。
    • 显微镜下观察炎症因子阳性表达区域（棕褐色）。
 

四、数据分析

  1. 统计学方法：

    • 数据以均值±标准差表示，GraphPad Prism软件分析。
    • 组间比较：t检验（两组）或单因素ANOVA（多组），*p<0.05为显著。

  2. 预期结果：

    • BDL组 vs Sham组：
      • 血清ALT/AST、总胆红素显著升高（验证模型成功）。
      • 血清及肝组织TNF-α、IL-1β、IL-6表达显著升高。
      • 肝组织HE染色可见胆管增生、炎性细胞浸润及坏死。
 

五、注意事项

  1. 术中严格无菌操作，减少感染风险。
  2. 结扎时避免损伤肝动脉和门静脉。
  3. 小鼠胆管纤细，建议使用显微手术器械。
  4. 炎症因子易降解，组织样本离体后速冻处理。
 

六、补充说明

  • 时间点选择：可增设多个时间点（如术后3、7、14天）观察炎症动态变化。
  • 延伸检测：
    • 肝组织羟脯氨酸含量（评估纤维化）。
    • 流式细胞术分析肝内免疫细胞浸润（如巨噬细胞、中性粒细胞）。
 

本方案提供从模型构建到炎症因子检测的全流程标准化操作，适用于胆汁淤积性肝病的机制及药物干预研究。