胆管结扎术（BDL）诱导肝硬化动物模型（大鼠/小鼠）的建立与检测
摘要： 胆管结扎术是诱导实验性胆汁淤积性肝纤维化及肝硬化的经典模型。本文详细描述了在大鼠和小鼠中实施胆总管结扎术的手术操作步骤、术后管理、动物福利要点以及用于评估肝硬化进展的关键检测指标和方法，为相关研究提供标准化操作参考。
一、 引言
胆汁淤积是多种慢性肝病的共同病理过程，最终可导致肝纤维化、肝硬化甚至肝功能衰竭。胆总管结扎术通过机械性阻塞胆汁流出道，模拟人类胆道梗阻性疾病（如胆总管结石、胆管狭窄、胆管癌等），在啮齿类动物（主要是大鼠和小鼠）中能快速、可靠地诱导出特征性的胆汁淤积、肝损伤、炎症反应、进行性肝纤维化直至肝硬化。
二、 实验动物
- 物种选择： 大鼠（常用Sprague Dawley, Wistar等品系，体重200-250g）或小鼠（常用C57BL/6, BALB/c等品系，体重20-25g）。小鼠手术操作难度显著高于大鼠。
- 饲养条件： SPF级动物房，标准光照周期（12h明/12h暗），自由饮水摄食。术前适应性饲养至少一周。
- 伦理审批： 所有实验操作必须事先获得所在机构动物实验伦理委员会的批准，严格遵守动物福利原则（如3R原则）。
三、 胆总管结扎术（BDL）手术操作流程
(注：手术需在无菌条件下进行)
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术前准备：
- 麻醉： 推荐使用吸入性麻醉剂（如异氟烷或七氟烷）进行诱导和维持。腹腔注射麻醉（如戊巴比妥钠或氯胺酮/赛拉嗪复合麻醉）亦可，需精确计算剂量并密切监测麻醉深度。
- 备皮与消毒： 剃除动物腹部手术区域毛发，使用碘伏溶液和75%乙醇交替消毒皮肤。
- 保温： 手术全程使用恒温垫或加热灯维持动物体温（大鼠37.5±0.5°C，小鼠37.0±0.5°C），防止术中低体温导致死亡。
- 器械： 准备无菌显微手术器械（精细镊、剪、持针器）、缝线（建议使用5-0或6-0不可吸收缝合线用于胆管结扎和切口缝合）、无菌纱布、棉签等。
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手术步骤：
- 切口： 沿腹正中线（白线）作约1.5-2cm（大鼠）或1-1.5cm（小鼠）切口，逐层切开皮肤和腹壁肌肉及腹膜，暴露腹腔。
- 定位胆总管： 轻柔地将肝脏向上轻推，用湿润的棉签将十二指肠袢和胃轻轻向左下方拨开，暴露位于肝十二指肠韧带内、门静脉前方的胆总管。胆总管呈透明或淡黄色细管状。
- 游离胆总管： 用精细显微镊或棉签尖端小心钝性分离胆总管周围结缔组织，使其游离出约3-5mm长度。操作务必轻柔，避免损伤伴行的门静脉和肝动脉（尤其是小鼠）。
- 结扎与离断：
- 使用5-0或6-0不可吸收缝合线，在靠近十二指肠乳头处的胆总管上进行双重结扎（两处结扎点间隔2-3mm）。结扎需牢固但避免过紧勒断胆管。
- 关键步骤： 在两道结扎线之间，用精细显微剪将胆总管完全剪断。这是确保胆道完全梗阻的关键。
- 关腹： 确认无活动性出血后，使用可吸收缝线连续或间断缝合腹膜和肌肉层，使用不可吸收缝线或皮肤缝合夹关闭皮肤切口。
- 假手术组： 作为对照组，仅进行开腹、暴露胆总管、游离但不进行结扎和离断，随即关腹。
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术后护理：
- 保温复苏： 将动物置于温暖（约30-32°C）、安静的笼盒中直至完全清醒（通常麻醉后30-60分钟）。术后24小时维持适宜环境温度至关重要。
- 镇痛： 术后必须提供有效镇痛。可在术前或术后立即皮下注射非甾体抗炎药（如卡洛芬、美洛昔康）或局部麻醉，并在术后24-72小时内按需重复给药。密切观察动物疼痛迹象（如蜷缩、竖毛、活动减少、攻击性增加、食欲不振）。
- 补液与营养支持： 术后初期动物可能因疼痛或麻醉影响而减少饮水和摄食。可皮下注射预热无菌生理盐水（1-2ml/100g体重）。在笼底放置湿润的软饲料或凝胶状饲料便于动物舔食。
- 密切观察： 术后每日至少观察动物两次，评估精神状态、活动度、切口情况、有无黄疸（皮肤、巩膜黄染）、尿液颜色（深黄色或茶色）、粪便颜色（灰白色或陶土色）。及时移除死亡动物并记录原因。
四、 模型特征与检测时间点
- 胆汁淤积与肝损伤： 术后数小时内即出现，血清胆红素（TBIL）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）显著升高，丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）升高反映肝细胞损伤。
- 炎症反应： 术后1-3天肝脏出现急性炎症浸润。
- 肝纤维化： 术后1周开始出现，胶原沉积逐渐增加。
- 肝硬化： 在大鼠模型中，通常在术后3-4周形成明确的肝硬化结节（假小叶形成）。小鼠模型进展相对更快，约2-3周可形成肝硬化。
- 门静脉高压： 常伴随肝硬化出现，可通过直接门静脉测压或间接指标（如脾肿大）评估。
- 肝功能障碍： 晚期可出现合成功能下降（如白蛋白降低、凝血时间延长）。
五、 肝硬化检测指标与方法
模型动物通常在预定终点（如大鼠术后28天，小鼠术后21天）进行安乐死并采样分析。
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大体观察与器官指数：
- 观察肝脏形态、颜色、质地、表面结节形成情况。
- 称量肝脏重量、脾脏重量，计算肝指数（肝脏重量/体重 × 100%）、脾指数（脾脏重量/体重 × 100%）。肝硬化常伴肝重下降（因肝细胞坏死减少）和脾肿大（门脉高压所致）。
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血清生化检测：
- 胆汁淤积指标： 总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）显著升高。
- 肝细胞损伤指标： 丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）升高（早期明显，后期可能因肝细胞广泛坏死而下降）。
- 肝脏合成功能： 白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）可能降低；凝血酶原时间（PT）/国际标准化比值（INR）延长反映凝血功能障碍。
- 其他： 总胆汁酸（TBA）显著升高。
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组织病理学评估（金标准）：
- 样本采集： 取相同肝叶（如左叶）组织块，置于10%中性福尔马林缓冲液中固定24-48小时。
- 切片与染色：
- 苏木精-伊红染色： 评估肝脏基本组织结构、肝细胞损伤（变性、坏死、气球样变）、炎症细胞浸润、胆管增生、假小叶形成。
- Masson三色染色/Sirius Red染色： 特异性显示胶原纤维（呈蓝色或红色），是评估纤维化程度和分布的最经典方法。
- 天狼星红染色偏振光观察： 可区分I型（强双折光，红/黄色）和III型（弱双折光，绿色）胶原，反映胶原成熟度。
- 纤维化半定量评分系统：
- 常用系统： Ishak评分、METAVIR评分、Scheuer评分或Knodell评分等。根据胶原沉积的范围、间隔形成、假小叶形成等对纤维化分期进行评分（如F0：无纤维化；F1：门管区纤维化扩大；F2：门管区周围纤维化，间隔形成；F3：桥接纤维化；F4：肝硬化）。
- 图像分析： 使用专业图像分析软件对Sirius Red或Masson染色切片进行定量分析，计算胶原面积百分比（%Collagen Area），提供更客观的纤维化程度量化数据。
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肝组织羟脯氨酸含量测定（生化定量金标准）：
- 羟脯氨酸是胶原蛋白的特征性氨基酸，其含量与肝脏总胶原含量高度相关。
- 取新鲜或冻存肝组织，酸水解后，利用比色法（如氯胺T法）或高效液相色谱法（HPLC）测定羟脯氨酸含量，结果常以μg/mg湿肝或μg/mg蛋白表示。
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分子生物学检测：
- 基因表达： RT-qPCR检测纤维化相关基因表达，如I型胶原（Col1a1, Col1a2）、III型胶原（Col3a1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，活化肝星状细胞标志物）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、基质金属蛋白酶（MMPs）及其组织抑制剂（TIMPs）、炎症因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）等。
- 蛋白表达： Western Blotting或免疫组织化学检测上述关键蛋白的表达水平及定位（如α-SMA在活化肝星状细胞中的表达，胶原蛋白在纤维间隔中的沉积）。
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门静脉压力测定（可选，评估门脉高压）：
- 在体直接插管测量门静脉压力。
六、 模型特点与注意事项
- 优点：
- 操作相对标准化，成模率高。
- 诱导的胆汁淤积、肝损伤、炎症、纤维化/肝硬化进程快速、明确。
- 病理变化与人类胆汁淤积性肝病相似。
- 缺点与挑战：
- 围手术期及术后早期死亡率（尤其小鼠）： 主要与手术操作损伤（出血、胆管撕裂）、麻醉意外、术后低体温、疼痛应激、胆道感染、肝衰竭等因素有关。精细操作、严格无菌、充分镇痛和保温是降低死亡率的关键。
- 急性模型特征： BDL诱导的是快速进展的胆汁淤积损伤和纤维化，与人类大多数由慢性肝炎或酒精性肝病等导致的肝硬化进程不同。其炎症反应在早期更剧烈。
- 门静脉高压表现： 虽然肝硬化形成，但BDL模型诱导的门静脉高压程度可能不如其他模型（如CCl4慢性中毒）显著，或需更长时间观察。
- 动物福利： 模型动物承受显著的痛苦（疼痛、瘙痒、代谢紊乱），需提供最优的镇痛和护理，严格遵守实验终点，避免不必要的痛苦。
- 替代方案：
- 对于小鼠，可选择胆总管单结扎而不离断（仅部分梗阻）以降低死亡率，但纤维化程度可能较轻且个体差异增大。
- 其他慢性肝纤维化模型（如四氯化碳CCl4腹腔注射、硫代乙酰胺TAA腹腔注射、胆碱缺乏氨基酸定义CDAA饮食）可能更适合研究非胆汁淤积性肝病的慢性纤维化进程。
七、 结论
胆管结扎术是建立胆汁淤积性肝纤维化和肝硬化动物模型的有效手段，尤其适用于研究该病理进程的机制及潜在治疗策略。成功建立模型依赖于精细的手术操作、严格的术后管理（尤其是镇痛和保温）以及对动物福利的最高标准遵循。通过结合血清生化、系统的组织病理学（包括纤维化定量评分和图像分析）、肝组织羟脯氨酸含量测定以及分子生物学检测，可以全面、客观地评估模型动物的肝硬化程度及治疗效果。研究者应根据具体科学问题和实验条件权衡该模型的适用性及其局限性。
参考文献： (此处应列出相关的经典方法学文献、综述及关键研究论文，例如涉及BDL手术方法、纤维化评分标准、羟脯氨酸测定方法的原始文献)。