胆碱缺乏饮食诱导肝纤维化(大鼠/小鼠)检测

胆碱缺乏饮食诱导大鼠/小鼠肝纤维化模型的建立与检测方法

摘要：
胆碱缺乏饮食（Choline-deficient diet, CDD）是建立啮齿类动物肝纤维化模型的经典方法。该模型通过干扰肝脏脂肪代谢与甲基供体供应，模拟人类非酒精性脂肪性肝炎（NASH）向纤维化发展的病理过程。本文详细阐述CDD诱导大鼠/小鼠肝纤维化的原理、模型建立步骤及关键检测方法，为相关研究提供标准化参考。

一、 模型诱导原理
肝脏磷脂酰胆碱（PC）合成依赖胆碱作为前体和甲基供体。CDD干扰：

1. VLDL合成障碍： PC是极低密度脂蛋白（VLDL）组装与分泌的关键成分。CDD导致肝脏甘油三酯（TG）输出受阻，引发脂肪变性。
2. 甲基供体缺乏： 胆碱是重要的甲基供体（参与S-腺苷甲硫氨酸循环）。其缺乏影响蛋白质合成、DNA甲基化及抗氧化反应（如谷胱甘肽合成）。
3. 氧化应激与炎症： 脂质堆积诱发活性氧（ROS）增加，损伤肝细胞膜（脂质过氧化），激活肝脏星状细胞（HSC），启动炎症和纤维化级联反应。

二、 模型建立方法

1. 动物选择：
   • 物种: 常用雄性Sprague-Dawley大鼠或C57BL/6小鼠。雄性更易感。
   • 年龄/体重： 大鼠：150-180g；小鼠：6-8周龄（约20g）。
   • 适应性喂养： 标准饲料喂养至少1周，适应环境。
2. 饲料配置（关键）：
   • 胆碱缺乏饲料: 基于基础纯化日粮（如AIN-76A或AIN-93G），完全去除胆碱（胆盐或氯化胆碱）。严格确保无胆碱来源。
   • 对照组饲料： 必须为同等基础日粮添加足量胆碱（通常0.1-0.2% w/w氯化胆碱）的配对饲料（Choline-sufficient diet, CSD）。仅用普通维持饲料做对照不严谨。
3. 饲养条件：
   • 自由饮水、进食。
   • 标准光照周期（如12h明/12h暗）。
   • 温度（22±2°C）、湿度（55±10%）控制。
   • 定期更换垫料，保持清洁。
4. 诱导周期：
   • 大鼠： 通常需持续喂养CDD 6-8周 可形成显著肝纤维化（早期纤维化约4周）。
   • 小鼠： 一般需要 8-12周 或更长时间（C57BL/6相对抵抗）。高脂胆碱缺乏（Choline-deficient, high-fat diet, CD-HFD）模型可加速进程（约4-8周）。
5. 实验终点与样本采集：
   • 禁食（如4-6小时）后麻醉处死动物。
   • 采集血液（分离血清/血浆）。
   • 迅速取出肝脏，称重。切取代表性肝叶组织块：
     • 固定于10%中性缓冲福尔马林（组织病理学）。
     • 速冻于液氮，转存-80°C（生化、分子生物学分析）。
     • 置于特定固定液（如用于胶原特异性染色）。

三、 肝纤维化关键检测指标与方法
(一) 整体观察与肝脏指数

• 动物状态： 观察活动度、毛色、精神状态。
• 肝脏大体形态： CDD组肝脏通常肿大、色黄、油腻、质脆，表面可能出现颗粒或结节。
• 肝指数： 肝湿重(g) / 动物体重(g) × 100%。CDD组显著高于CSD对照组。

(二) 血清/血浆生化指标

1. 肝功能损伤：
   • 丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）： 显著升高，反映肝细胞损伤。
2. 脂质代谢：
   • 甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）： 血清TG可能降低（因VLDL输出障碍），肝脏TG显著堆积；血清TC变化不定。
3. 肝纤维化血清学标志物（辅助）：
   • 透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原氨基端肽（PIIINP）、IV型胶原（CIV）： 水平可升高，反映细胞外基质合成与降解动态。

(三) 肝脏组织病理学检查（金标准）

1. 苏木素-伊红（H&E）染色：
   • 脂肪变性（Steatosis）： CDD模型核心特征。评估脂肪变程度（面积%）及类型（大泡性为主）。
   • 肝细胞损伤： 气球样变、点状/灶性坏死。
   • 炎症浸润（Lobular Inflammation）： 肝小叶内混合炎症细胞（中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞）浸润。CDD模型常伴明显炎症（类似NASH）。
2. 特殊染色（评估纤维化沉积）：
   • 天狼星红（Sirius Red）染色： 最常用、特异性强。 胶原纤维染成红色/橙红色，在偏振光下呈双折光性（I型胶原为主，III型也着色）。定量分析纤维化面积%或根据半定量评分系统（如Ishak, METAVIR, NASH CRN）评估分期（Stage）。
   • 马松三色（Masson’s Trichrome）染色： 胶原纤维染成蓝色/绿色，肌纤维红色，胞核深蓝色。广泛使用，可较好显示肝窦周（窦周）纤维化和汇管区纤维化。
3. 纤维化评分系统（示例，常用NASH CRN或Ishak）：
   • 0期（F0）： 无纤维化。
   • 1期（F1）： 汇管区纤维化扩大（限于窦周或汇管区）。
   • 2期（F2）： 汇管区周围纤维化，局灶性或广泛桥接（汇管区-汇管区桥接）。
   • 3期（F3）： 广泛桥接纤维化（汇管区-中央静脉桥接）。
   • 4期（F4）： 肝硬化。

(四) 肝脏组织生化与分子生物学检测

1. 羟脯氨酸（Hyp）含量测定： 胶原蛋白特征性氨基酸。肝脏Hyp含量与胶原沉积量正相关。需酸水解组织后定量检测（比色法或高效液相色谱法）。
2. 纤维化相关基因表达：
   • qRT-PCR： 检测促纤维化因子（TGF-β1）、细胞外基质（ECM）成分（Col1a1, Col3a1, α-SMA, TIMP1）及炎症因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）等的mRNA水平升高。
3. 纤维化相关蛋白表达：
   • Western Blot / 免疫组织化学（IHC）： 检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA - HSC活化标志物）、I/III型胶原、TGF-β1等蛋白的表达水平及定位（如α-SMA在活化HSC和肌成纤维细胞中表达）。

四、 注意事项与模型优缺点

• 注意事项：
  • 严格配对饲料（CSD vs CDD）是实验设计的核心，确保差异仅源于胆碱。
  • 饲料需严格储存（如避光、4°C或-20°C冷藏），防止成分降解。
  • 动物周龄、性别、品系选择需一致并明确报告。
  • 组织切片应由有经验的病理学家盲法阅片评分。
• 优点：
  • 机制明确，较好地模拟人类NASH→纤维化病理进程（脂肪变、炎症、纤维化）。
  • 操作相对简单（只需特殊饲料）。
  • 可诱导出明确的肝纤维化甚至早期肝硬化。
• 缺点/局限：
  • 诱导周期较长（尤其小鼠）。
  • 肝损伤和炎症可能较显著。
  • “胆碱缺乏”本身是人类NASH的罕见病因，模型具有“药理”特性。
  • 动物可能伴随体重减轻（尤其大鼠），需关注动物福利。

结论：
胆碱缺乏饮食通过干扰肝脏脂质代谢和甲基化过程，能有效诱导大鼠和小鼠产生脂肪性肝炎和肝纤维化。该模型的成功建立依赖于严格的饲料控制和对诱导周期的把握。综合运用组织病理学（尤其是天狼星红染色纤维化分期）、血清生化指标（ALT/AST）、肝脏脂质含量、羟脯氨酸测定以及纤维化相关基因/蛋白表达分析，可全面、客观地评估肝损伤和纤维化程度。理解其优缺点对于合理应用该模型研究肝纤维化机制及干预策略至关重要。

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