四氯化碳诱导肝纤维化(大鼠/小鼠)检测

发布时间：2025-07-04 13:40:01 阅读量：4 作者：生物检测中心

四氯化碳诱导啮齿类动物肝纤维化模型的建立与检测方法

摘要：
四氯化碳（CCl₄）诱导的肝纤维化模型是研究肝纤维化发病机制和评估潜在治疗策略的经典实验工具。本方案详细描述了在大鼠或小鼠体内使用四氯化碳建立肝纤维化模型的关键步骤，以及用于评估纤维化程度的标准化检测方法。

一、引言
肝纤维化是慢性肝损伤后过度的伤口愈合反应，其特征是细胞外基质（ECM）特别是胶原蛋白的过度沉积和异常积累。四氯化碳作为一种肝毒性物质，被肝脏细胞色素P450酶系（主要是CYP2E1）代谢生成高活性自由基（如•CCl₃和•OOCCCl₃），引发肝细胞膜脂质过氧化、细胞坏死/凋亡，进而激活肝星状细胞（HSCs），促使其转化为肌成纤维细胞样细胞并大量合成ECM，最终导致肝纤维化形成。该模型能较好模拟人类肝纤维化的病理进程，具有操作相对简单、成模时间可控、纤维化程度较均一等优点。

二、材料与方法

1. 实验动物：

  • 物种选择：成年健康Sprague-Dawley（SD）或Wistar大鼠；C57BL/6或BALB/c小鼠。大鼠耐受性通常优于小鼠。
  • 体重/年龄：大鼠：180-220g；小鼠：18-22g（约6-8周龄）。
  • 饲养条件：SPF级动物房，标准饲料，自由饮水，12小时光暗循环，实验前适应环境至少1周。
 

2. 主要试剂与仪器：

  • 四氯化碳（CCl₄）
  • 溶剂：玉米油或橄榄油（推荐使用，毒性相对较低）
  • 麻醉剂：水合氯醛（10%）或异氟烷
  • 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）
  • 多聚甲醛（4%，用于组织固定）
  • 苏木精-伊红（H&E）染色试剂盒
  • 天狼星红（Sirius Red）染色试剂盒
  • Masson三色染色试剂盒
  • 羟脯氨酸（Hyp）检测试剂盒
  • 血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）检测试剂盒
  • 所需一抗与二抗（如用于α-SMA免疫组化）
  • 组织脱水机、包埋机、石蜡切片机
  • 光学显微镜（配备图像分析软件）
  • 分光光度计/酶标仪
  • 离心机
  • 通风橱（必备）
 

3. 模型建立（操作需在通风橱内进行并佩戴防护装备）

  • CCl₄溶液配制： 根据实验设计浓度（v/v），将CCl₄原液溶解于玉米油或橄榄油中。常用浓度范围：
    • 大鼠： 0.5 - 2 ml/kg体重（常用起始剂量0.5-1 ml/kg，后续根据动物状态和预期损伤程度调整）。
    • 小鼠： 0.2 - 1 ml/kg体重（常用起始剂量0.2-0.5 ml/kg）。注意：剂量是关键变量，需预实验优化。
  • 给药途径： 腹腔注射（i.p.）为主。皮下注射（s.c.）亦可，但诱导速度可能稍慢。
  • 给药频率：
    • 急性损伤模型： 单次注射，24-72小时后取材观察急性肝损伤。
    • 慢性肝纤维化模型（常用）： 每周给药1-2次（常用2次，如周一和周四）。诱导时间通常需要6-8周才能形成显著纤维化。
  • 对照组设置：
    • 正常对照组 (Control)： 仅注射等体积溶剂（玉米油/橄榄油）。
    • 模型组 (CCl₄)： 注射CCl₄油溶液。
    • (可选) 治疗组： 在造模同时或成功后给予待研究的干预药物。
 

4. 样本采集

  • 禁食： 实验结束前禁食约12小时（自由饮水）。
  • 麻醉： 使用合适麻醉剂（如10%水合氯醛腹腔注射）。
  • 血液采集： 经腹主动脉或心脏穿刺采集全血，室温静置凝固后离心（3000 rpm，10-15 min），分离血清，保存于-80°C用于生化指标检测。
  • 肝脏采集：
    1. 颈椎脱臼法处死动物。
    2. 迅速打开腹腔，完整取出肝脏。
    3. 用预冷的PBS冲洗肝脏表面血迹，滤纸吸干。
    4. 称重： 记录肝脏湿重。
    5. 分装：
      • 取左叶或右叶同一部位（确保可比性）约1cm³组织块，立即投入4%多聚甲醛溶液中固定（室温≥24小时，用于组织病理学）。
      • 取约100mg肝组织（避开固定区域），液氮速冻后转移至-80°C保存（用于羟脯氨酸含量、RNA、蛋白提取等生化/分子生物学分析）。
      • (可选) 取部分新鲜肝组织用于其他即时分析（如流式细胞术）。
 

5. 纤维化评估方法

  • 肝功能血清学指标：

    • 检测项目： 谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）。反映肝细胞损伤程度。
    • 方法： 使用商品化试剂盒，严格按说明书操作（通常基于速率法），在分光光度计或酶标仪上读取吸光值计算浓度。模型组ALT/AST水平通常显著高于对照组。

  • 肝组织病理学评估（金标准）：

    1. 组织处理： 固定好的组织块经梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（厚度4-5μm）。
    2. 染色方法：
      • H&E染色： 常规观察肝脏结构、坏死、炎症细胞浸润、脂肪变性等基本病理变化。
      • 胶原纤维特异性染色（核心评估纤维化）：
        • 天狼星红染色 (Sirius Red)： 胶原纤维呈鲜红或橙红色。偏振光显微镜下观察，I型和III型胶原呈现不同颜色（I型黄/橙红，III型绿），便于区分胶原类型。推荐首选，尤其适合半定量分析。
        • Masson三色染色： 胶原纤维呈蓝色，肌肉、胞质呈红色，胞核呈蓝黑色。经典易行。
    3. 纤维化程度半定量评分：
      • 常用评分系统：Ishak评分（0-6分）、METAVIR评分（F0-F4）或Scheuer评分（S0-S4）。由两名以上经验丰富的病理学家在盲法下阅片。
      • 评估要点：纤维间隔（宽度、数量、连接情况）、小叶结构改变、假小叶形成（肝硬化）。
    4. 胶原面积定量分析：
      • 对天狼星红或Masson染色切片进行数字化扫描或高分辨率拍照（多个随机视野）。
      • 使用专业图像分析软件（如Image-Pro Plus, ImageJ/Fiji）计算视野中阳性染色（红色或蓝色）区域占总面积的比例(%)，以反映胶原沉积程度。结果更客观。

  • 肝组织羟脯氨酸（Hyp）含量测定（生化金标准）：

    1. 原理： Hyp是胶原蛋白的特征性氨基酸，其含量与肝组织总胶原含量成正比。
    2. 步骤： 取冻存肝组织，精确称重→酸水解（6M HCl，110°C，16-24h）→中和水解产物→使用商品化试剂盒（常用氯胺T氧化法或ELISA法）检测Hyp浓度。
    3. 结果表示： 通常以微克羟脯氨酸每毫克肝组织湿重（μg Hyp/mg liver）或每克肝组织湿重（μg Hyp/g liver）表示。模型组Hyp含量显著高于对照组。

  • 免疫组织化学/免疫荧光染色（评估HSC活化）：

    • 靶蛋白： α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），是活化的HSC的标志物。
    • 方法： 石蜡切片进行常规脱蜡至水→抗原修复→封闭→孵育一抗（抗α-SMA抗体）→孵育HRP/荧光标记二抗→显色/DAPI衬染→封片观察。
    • 评估： 显微镜下观察α-SMA阳性细胞（胞浆着色）的数量和分布（主要在纤维间隔和窦周隙）。可进行阳性面积半定量或定量分析。

  • 其他可选检测：

    • 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)： 检测纤维化相关基因（如Col1a1、Col3a1、Timp1、Mmp13、Acta2(α-SMA)、Tgfb1）的mRNA表达水平。
    • Western Blot： 检测纤维化相关蛋白（如Collagen I, α-SMA, TIMP-1, TGF-β）的表达水平。
    • 肝组织总胶原含量检测试剂盒： 提供另一种测量总胶原的方法。
 

三、结果分析与报告

  • 系统呈现各组数据（均值±标准差）。
  • 血清学：ALT、AST水平。
  • 组织病理学：展示代表性H&E、天狼星红/Masson染色切片照片；纤维化评分结果；胶原面积定量百分比结果。
  • 生化：肝组织羟脯氨酸含量(μg/mg)。
  • 免疫组化：α-SMA阳性表达的代表性照片及半定量/定量结果。
  • 统计分析：根据数据分布特征和实验设计，选择合适的统计方法（如t检验、单因素/双因素方差分析+事后检验）。P值小于0.05通常认为有统计学意义。
  • 结论应明确CCl₄是否成功诱导肝纤维化及其程度。
 

四、关键注意事项与优化

  1. 剂量与频率优化： 这是模型成功的关键。不同品系、来源、批次的动物对CCl₄敏感性存在差异。务必进行预实验，从小剂量开始，密切观察动物状态（精神、活动、毛发、体重），根据体重变化和死亡率（目标控制在<20%）调整后续剂量和频率。目标是建立稳定的进行性纤维化模型而非导致动物短期内大量死亡。
  2. 溶剂选择： 推荐使用玉米油或橄榄油，毒性低于矿物油。
  3. 动物福利： 严格遵守动物伦理学规定。模型建立过程中动物承受痛苦（注射、肝损伤不适），需密切观察，提供充足饮食饮水。出现严重衰竭、濒死状态应及时人道处死。动物体重持续显著下降是重要的耐受不良信号。
  4. 操作安全： CCl₄具有剧毒和致癌性。所有涉及CCl₄的操作（配制、注射）必须在通风良好的化学通风橱内进行！操作人员必须佩戴合适的防护设备：双层手套（丁腈手套）、防护眼镜、实验服，必要时佩戴防毒面具。严格按规定处理废弃CCl₄溶液、动物尸体及被污染的垫料。
  5. 取材一致性： 肝脏不同叶的纤维化程度可能存在差异。固定取材部位对保证组间可比性至关重要，通常选左叶或右叶的特定位置。
  6. 固定及时充分： 肝组织离体后应尽快固定，确保固定液体积足够（10倍于组织体积），固定时间充分（通常≥24小时），以保证后续切片和染色质量。
  7. 严谨的对照： 设置严格的溶媒对照组是准确评价模型效果和药物干预作用的基础。
  8. 盲法评估： 病理阅片及图像分析应尽量采用盲法进行，以减少主观偏倚。
  9. 多方法联合： 纤维化评估应结合组织形态学（染色+评分+胶原面积定量）和胶原生化定量（羟脯氨酸），辅以血清学指标和活化HSC标志物检测，提供更全面、可靠的结果。
 

五、结论
四氯化碳诱导的啮齿类动物肝纤维化模型是一种成熟且应用广泛的实验工具。通过精细控制给药剂量、频率，结合规范的样本采集、全面的组织病理学评估（尤其天狼星红染色结合图像分析）和生化检测（羟脯氨酸），能够可靠地模拟肝纤维化的发生发展过程。该模型对于深入探讨肝纤维化的分子机制和筛选评估潜在的抗纤维化治疗策略具有重要价值。研究者需始终将动物福利和实验人员安全置于首位。

参考文献： (此处列出若干篇经典文献和方法学论文供参考，实际写作需引用具体文献)

  1. Friedman, S. L. (2008). Mechanisms of hepatic fibrogenesis. Gastroenterology, 134(6), 1655-1669. (机制综述)
  2. Iredale, J. P. (2007). Models of liver fibrosis: exploring the dynamic nature of inflammation and repair in a solid organ. Journal of Clinical Investigation, 117(3), 539-548. (模型综述)
  3. Jeong, D. H., Lee, G. P., Jeong, W. I., Do, S. H., Yang, H. J., Yuan, D. W., ... & Jeong, K. S. (2005). Alterations of mast cells and TGF-β1 on the silymarin treatment for CCl₄-induced hepatic fibrosis. World Journal of Gastroenterology, 11(8), 1141. (应用实例)
  4. Lopez-De Leon, A., & Rojkind, M. (1985). A simple micromethod for collagen and total protein determination in formalin-fixed paraffin-embedded sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 33(8), 737-743. (羟脯氨酸方法)
  5. Lotersztajn, S., Julien, B., Teixeira-Clerc, F., Grenard, P., & Mallat, A. (2005). Hepatic fibrosis: molecular mechanisms and drug targets. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 45, 605-628. (机制与靶点)
  6. Nature Protocols 或 Journal of Visualized Experiments (JoVE) 上关于CCl₄模型建立的详细视频方法学文章。
 

注意事项：

  • 本方案为通用指南，具体实验参数需根据实验室条件、动物品系及具体科研问题进行优化和标准化。
  • 所有动物实验必须获得所在机构动物伦理委员会（IACUC或类似机构）的批准后方可进行。
  • 严格遵守实验室生物安全规范处理化学品（特别是CCl₄）和生物废弃物。