siRNA 合成

siRNA合成与检测项目详解

siRNA（小干扰RNA）是基因沉默研究及RNA疗法中的关键工具，其合成质量直接影响实验效果和治疗安全性。本文将系统阐述siRNA的合成方法，并重点解析其关键检测项目，为科研与生产提供质量控制参考。

一、siRNA合成方法概述

1. 化学合成法 通过固相合成技术逐步连接核苷酸，适合大规模生产，但需严格纯化去除未反应单体及短链副产物。

2. 体外转录法 利用噬菌体RNA聚合酶（如T7）合成双链RNA，需DNase处理模板DNA，并通过切胶纯化目标产物。

3. 载体表达法 质粒或病毒载体在细胞内表达shRNA，经Dicer加工生成siRNA，需提取总RNA并通过Northern blot验证。

二、核心检测项目及方法

1. 纯度分析

   • 目的：检测完整siRNA占比及杂质（如盐离子、短链）。
   • 方法：
     • 反相HPLC：C18柱分离，紫外检测（260 nm），纯度应＞90%。
     • 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：15%非变性胶，银染或SYBR Gold显示单一清晰条带。

2. 浓度与OD值测定

   • 紫外分光光度法：A260计算浓度（1 OD≈40 μg/ml单链RNA），OD260/280比值1.8-2.1表明无蛋白污染。
   • 荧光定量法：RiboGreen染料提高低浓度样本灵敏度。

3. 序列准确性验证

   • MALDI-TOF质谱：分子量偏差需＜0.1%（如21-mer siRNA理论值≈13.8 kDa）。
   • 二代测序（NGS）：适用于大规模合成质控，覆盖率＞99%。

4. 无菌与内毒素检测

   • 无菌试验：膜过滤法接种TSB培养基，37℃培养14天无微生物生长。
   • 内毒素检测：鲎试剂动态显色法，限值＜0.25 EU/µg。

5. 功能活性验证

   • 体外沉默效率：转染靶细胞（如HeLa），qPCR/Western blot检测基因表达抑制率（通常＞70%）。
   • 荧光报告系统：构建含靶序列的荧光素酶载体，转染后检测荧光强度下降。

6. 稳定性评估

   • 血清稳定性实验：37℃胎牛血清中孵育，定时取样跑胶，半衰期应＞24小时（化学修饰型siRNA可达72小时）。
   • 长期储存试验：-80℃、-20℃及4℃保存，定期检测降解程度。

7. 细胞毒性检测

   • CCK-8法：转染后48小时检测细胞活力，存活率需＞85%。
   • LDH释放试验：评估膜完整性，毒性阈值＜15%对照。

三、质量控制标准表

四、储存与运输规范

• 冻干粉：-20℃保存3年，复溶后-80℃分装，避免反复冻融（≤3次）。
• 液体形式：含RNase抑制剂缓冲液，-80℃运输需干冰维持。

五、总结

严格的siRNA质量检测是确保基因沉默效果和降低脱靶效应的核心。通过多维度的理化分析、功能验证及稳定性测试，可系统评估产品性能，为基础研究及临床转化提供可靠工具。未来随着纳米载体递送技术的发展，siRNA的体内外检测体系需进一步适配复杂应用场景。