细胞自噬检测

发布时间：2025-07-04 12:28:11 阅读量：1 作者：生物检测中心

细胞自噬检测：方法与解读

细胞自噬是真核细胞中高度保守的自我降解过程。通过形成双层膜结构的自噬体包裹胞质成分（如受损细胞器、错误折叠蛋白和入侵病原体），并将其运送至溶酶体进行降解和回收利用，自噬在维持细胞稳态、应对应激（如营养缺乏、氧化应激、感染）以及发育和衰老等生理病理过程中扮演核心角色。因此，准确检测自噬活性对于理解其在生理和疾病中的作用至关重要。

检测细胞自噬是一个多层面的挑战，因为自噬是一个动态的多步骤过程（诱导、成核、延伸、成熟、降解）。单一方法往往不足以全面评估自噬流（autophagic flux），即自噬从起始到降解底物的完整通量。通常需要结合多种方法进行综合分析。

I. 稳态检测（Steady-State Measurements）

主要检测特定时间点自噬相关分子或结构的数量，反映自噬体的“累积水平”，但无法直接区分自噬是增强（诱导增加）还是受阻（降解受阻）。

  1. 自噬体形态学观察：

    • 透射电子显微镜： 这是检测自噬结构的金标准。可清晰观察双层膜（或成熟过程中单层膜）的自噬体（包含胞质物质或细胞器）以及自噬溶酶体（单层膜，内含处于不同降解阶段的物质）。提供最直接的形态学证据，但操作复杂、样本制备要求高且通量低。
    • 荧光显微镜：
      • 荧光标记自噬标记物： 常用方法是将荧光蛋白（如GFP、mCherry、RFP）融合到微管相关蛋白1轻链3（LC3）。LC3-I（胞质可溶形式）在自噬诱导时，经泛素化样修饰（与磷脂酰乙醇胺PE结合）形成LC3-II，后者定位于自噬体膜（点状/泡状结构）。通过荧光显微镜可计数LC3阳性点状结构（puncta）的数量或面积。但LC3 puncta的增加可能源于自噬诱导增强或下游降解受阻（如溶酶体功能抑制）。
      • 特异性自噬受体标记： 如SQSTM1/p62（连接泛素化底物与LC3）。p62本身是自噬降解的底物。稳态水平下，p62蛋白水平通常与自噬活性呈负相关（自噬强则p62降解多，水平低）。也可观察p62阳性聚集体的形成（常在自噬抑制时累积）。需结合降解实验。
      • 双荧光标记法（如mRFP-GFP-LC3）： 利用GFP在溶酶体酸性环境中淬灭而mRFP稳定的特性。黄色斑点（GFP和mRFP信号重叠）代表自噬体（中性pH），红色斑点（仅mRFP信号）代表自噬溶酶体（酸性pH）。通过计算红/黄斑点比例可评估自噬流的通畅性（比例高说明自噬体成熟降解顺畅）。

  2. 自噬相关蛋白的免疫印迹分析：

    • LC3-I/LC3-II转换： LC3-II是自噬体膜结合的标志。通过蛋白质免疫印迹检测LC3-II水平或其与LC3-I的比值是常用方法。增加通常提示自噬体累积。关键点：LC3-II水平受合成、修饰和降解速率影响；样本处理需快速且防止蛋白降解；LC3-II本身也会被溶酶体降解。
    • p62/SQSTM1蛋白水平： 如前所述，p62是选择性自噬的底物和受体。在自噬流通畅的情况下，自噬活性增强通常伴随p62蛋白水平降低；反之，抑制自噬降解会导致p62累积。因此，p62水平常作为自噬流的下游指标，需结合LC3-II等指标解读。
    • 其他自噬相关蛋白： 如ATG5, ATG7, Beclin 1等。这些蛋白参与自噬体形成，其表达水平变化有时被检测，但其变化不一定直接反映自噬活性（可能受转录调控），更多用于机制研究。
 

II. 自噬流检测（Autophagic Flux Assays）

旨在评估自噬从起始到降解底物的动态过程，是判断自噬活性强弱的关键。

  1. 溶酶体抑制剂阻断降解法：

    • 原理： 使用溶酶体蛋白酶抑制剂（如E64d、Pepstatin A）或溶酶体酸化抑制剂（如氯喹、巴佛洛霉素A1）阻断自噬体与溶酶体融合或溶酶体降解功能。如果自噬流活跃，阻断降解会导致自噬体及其携带的底物（如LC3-II, p62）在细胞内显著累积。
    • 应用：
      • LC3-II累积： 比较抑制剂处理组与对照组的LC3-II水平（Western Blot）或LC3 puncta数量（显微镜）。抑制剂处理组LC3-II累积越多，说明基础自噬流越强。
      • p62累积： 比较抑制剂处理组与对照组的p62蛋白水平。抑制剂处理组p62累积越多，说明基础状态下p62主要通过自噬-溶酶体途径降解，其降解速率快（即自噬流强）。如果基础p62水平就很高且抑制剂处理不引起累积，可能提示自噬流本身受阻。
      • 降解速率测定： 例如，通过环己酰亚胺阻断新蛋白合成后，追踪特定自噬底物（如长寿命蛋白、p62、LC3-II）随时间的降解速率。

  2. 基于荧光蛋白淬灭的成像分析：

    • 原理： 如前述的mRFP-GFP-LC3报告系统。自噬体（中性）呈黄色（GFP+mRFP+），自噬溶酶体（酸性）呈红色（仅mRFP+）。
    • 解读自噬流：
      • 诱导自噬后，若红色斑点显著增加（或红/黄比值升高），表明自噬体成熟形成自噬溶酶体顺畅（自噬流通畅增强）。
      • 若黄色斑点大量累积而红色斑点很少（红/黄比值低），则提示自噬体形成后未能有效成熟降解（自噬流受阻）。
      • 此方法能相对直观地在单细胞水平反映自噬流的阶段。

  3. 长寿命蛋白降解率测定：

    • 原理： 自噬主要降解长寿命蛋白。用放射性同位素（如³H-亮氨酸）或稳定同位素（如含重氨基酸培养基）标记细胞总蛋白。洗去标记物后，让细胞在完全培养基中孵育一段时间（耗尽短寿蛋白）。然后测量残留在细胞内的放射性或重同位素标记蛋白的降解速率（反映长寿蛋白降解）。
    • 解读： 降解率的增加常反映了自噬活性的增强（尤其是非选择性自噬）。需注意泛素-蛋白酶体途径主要降解短寿蛋白，此实验需通过抑制蛋白酶体（如MG132）来突显自噬的作用。该方法是检测整体自噬活性的经典方法之一，但操作较繁琐。
 

III. 选择性自噬检测

针对特定类型选择性自噬（如线粒体自噬、aggrephagy等）的检测方法。

  1. 特定底物的共定位分析：

    • 原理： 利用荧光显微镜观察待降解的特定底物（如受损线粒体用Mitotracker标记，泛素化蛋白聚集体用泛素抗体标记）与自噬标记物（如LC3, p62）的共定位情况。
    • 方法：
      • 免疫荧光/免疫组化共染色（如TOMM20/LC3 共定位检测线粒体自噬）。
      • 荧光标记底物与荧光标记LC3或p62的报告细胞系共转染/感染。
    • 解读： 共定位点（如黄色斑点）的增加提示该特定底物被招募到自噬体中，表明该选择性自噬途径被激活。

  2. 特定受体依赖途径的分析：

    • 针对特定选择性自噬受体（如线粒体自噬的FUNDC1, BNIP3, NIX; 聚集体自噬的p62, NBR1; 内质网自噬的FAM134B, CCPG1等）进行检测：
      • 受体蛋白表达水平（Western Blot, qPCR）。
      • 受体与LC3的相互作用（如免疫共沉淀Co-IP）。
      • 受体与特定底物的共定位分析。
      • 研究特定应激条件（如线粒体去极化剂CCCP诱导线粒体自噬）下，受体缺失或过表达对选择性自噬的影响。
 

IV. 注意事项与结果解读

  • 动态性与语境： 自噬水平是动态变化的，检测结果需结合具体的处理条件、时间点和细胞类型来解读。
  • 区分诱导与阻断： 稳态标志物（如LC3 puncta, LC3-II水平）的增加可能源于自噬诱导增强，也可能源于下游降解受阻（自噬流抑制）。必须通过自噬流检测（如溶酶体抑制剂实验、双荧光报告系统）来区分。
  • 方法互补： 没有单一完美的检测方法。应结合至少两种不同原理的方法（如显微镜观察+Western Blot检测LC3-II和p62的变化+溶酶体抑制剂实验）进行综合判断，才能更可靠地评估自噬活性和通量。
  • 样本处理： 样本处理（如固定、裂解）必须标准化和快速，尤其是对于不稳定的蛋白（如LC3-II）和磷酸化蛋白。
  • 诱导条件： 检测基础自噬或应激诱导自噬时，使用公认的诱导剂（如营养缺乏/Earle’s平衡盐溶液、雷帕霉素）或抑制剂作为阳性对照非常重要。
  • 细胞活力： 自噬剧烈扰动或长期抑制可能影响细胞活力，进而影响结果解读。需关注细胞状态。
  • 特异性： 某些试剂（如氯喹）可能具有除抑制溶酶体以外的其他效应。注意实验设计的严谨性和对照的设置。
 

结语

细胞自噬检测是研究这一复杂生物学过程的基础。理解各种方法的原理、优势、局限性和适用场景，并采取组合策略进行自噬流的动态评估，对于获得准确可靠的自噬活性信息至关重要。随着新技术的发展（如高内涵成像、新型荧光报告系统），自噬检测的方法也在不断进步和完善，为深入探究自噬在生理和病理过程中的精细调控提供了有力工具。

图片描述建议：

  1. 细胞自噬过程示意图： 展示自噬诱导、吞噬泡形成、自噬体形成、自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体、内容物降解和回收利用的完整动态过程。标注关键结构（隔离膜、自噬体、溶酶体、自噬溶酶体）和关键分子（ULK复合物、PI3K复合物、ATG蛋白、LC3转化、p62、自噬受体、溶酶体酶）。
  2. (可选) 关键检测方法原理示意图：
    • 透射电镜下的自噬体/自噬溶酶体典型形态。
    • GFP-LC3 / mRFP-GFP-LC3荧光显微镜图像对比（显示点状结构）。
    • LC3-I 向 LC3-II 转化的Western Blot示意图及条带示例。
    • p62蛋白水平随自噬状态变化的Western Blot示意图。
    • 溶酶体抑制剂（如氯喹）作用原理及对LC3-II累积的影响示意图。
    • 线粒体（红色荧光）与LC3（绿色荧光）共定位（黄色斑点）示意图（代表线粒体自噬）。