细胞凋亡TUNEL法

TUNEL法检测细胞凋亡：原理、操作与应用详解

细胞凋亡（Apoptosis）是生物体内重要的程序性细胞死亡过程，在多细胞生物体的发育、组织稳态维持及疾病发生中扮演关键角色。准确检测凋亡对理解相关生理病理机制至关重要。TUNEL法（末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记法） 因其直接标记凋亡细胞DNA断裂末端的特性，成为该领域广泛应用的核心技术。

一、 核心原理

细胞凋亡晚期，内源性核酸内切酶被激活，将基因组DNA在核小体间切割，产生大量带有游离3'-羟基（-OH）末端的DNA片段。TUNEL法正是利用这一生化特征：

1. 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）：该酶能催化脱氧核苷酸（通常为标记的dUTP）连接到DNA片段的3'-OH末端，无需模板。
2. 标记的dUTP：通常使用荧光素（如FITC）或生物素标记的dUTP作为底物。酶促反应后，标记的dUTP被掺入到DNA断裂末端。
3. 信号检测：
   • 荧光检测：若使用荧光素-dUTP（如FITC-dUTP），标记后的细胞可在荧光显微镜下直接观察，阳性信号（凋亡细胞）发出绿色荧光。
   • 显色检测：若使用生物素-dUTP，需再与辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记的链霉亲和素结合，最后加入相应底物（如DAB）产生显色反应，可在普通光学显微镜下观察阳性信号（棕色或红色沉淀）。

二、 标准实验流程（以石蜡切片为例）

1. 样本准备与固定：

   • 组织样本经4%多聚甲醛（或10%中性福尔马林）充分固定。
   • 梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片（厚度通常4-6μm）。
   • 贴片于经处理的载玻片上，60°C烘片过夜以增强粘附性。

2. 脱蜡与水化：

   • 二甲苯I、II各脱蜡10分钟。
   • 梯度乙醇（100%、95%、85%、70%）水化，各5分钟。
   • 磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗2次，每次5分钟。

3. 通透处理：

   • 蛋白酶K工作液（常用浓度范围10-20 μg/mL）室温或37°C孵育15-30分钟（关键步骤，需优化浓度与时间）。
   • PBS漂洗3次，每次5分钟。

4. 内源性过氧化物酶/磷酸酶阻断（显色法必需）：

   • 用含3% H₂O₂的甲醇或专用阻断剂室温处理10分钟，阻断内源性过氧化物酶。
   • PBS漂洗3次，每次5分钟。
   • （若用AP显色，则需相应阻断内源性碱性磷酸酶）。

5. TdT酶反应混合液孵育：

   • 按试剂组分说明，新鲜配制TdT反应缓冲液：含TdT酶、标记dUTP（如FITC-dUTP或生物素-dUTP）、适量缓冲盐溶液。
   • 甩去PBS，用吸水纸吸干切片周围液体（避免稀释反应液）。
   • 将适量TdT反应混合液均匀覆盖组织，置于湿盒中，37°C避光孵育60分钟（时间可优化）。
   • 阴性对照：反应液中不加TdT酶。
   • 阳性对照：使用已知凋亡的组织切片或DNase I处理的切片。

6. 终止反应与清洗：

   • 终止缓冲液（如含EDTA的缓冲盐溶液）室温孵育10-15分钟。
   • PBS漂洗3次，每次5分钟。

7. 信号检测：

   • 荧光检测（FITC-dUTP）：
     • 甩干PBS，滴加含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片。
     • 荧光显微镜下观察：FITC通道（绿光）显示凋亡细胞，DAPI（蓝光）显示所有细胞核。
   • 显色检测（生物素-dUTP）：
     • 滴加封闭血清室温孵育20分钟。
     • 滴加HRP或AP标记的链霉亲和素工作液，37°C孵育30分钟。
     • PBS漂洗3次，每次5分钟。
     • 滴加显色底物（如DAB for HRP, 显色时间需优化），显微镜下控制显色程度。
     • 自来水充分冲洗终止显色。
     • 苏木素复染细胞核（约1-2分钟），自来水冲洗返蓝。
     • 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
     • 光学显微镜下观察：阳性信号为细胞核内棕褐色颗粒（DAB显色）或红色（如AEC显色）。

8. 结果分析：

   • 荧光法：计数多个视野中FITC阳性（绿色）细胞核占总DAPI阳性（蓝色）细胞核的百分比。
   • 显色法：计数多个视野中显色阳性细胞核占总细胞核的百分比。
   • 可结合图像分析软件进行半定量分析。

三、 TUNEL法的优势与局限性

• 优势：
  • 特异性高：直接标记凋亡晚期DNA断裂特征性产物，是凋亡的“金标准”之一。
  • 灵敏度高：可检测单个凋亡细胞。
  • 适用性广：可用于多种样本（冰冻切片、石蜡切片、细胞涂片、培养细胞）、组织类型及不同物种。
  • 定位精确：可精确定位于细胞核内。
  • 双标兼容：荧光法易与其他标记（如特定蛋白免疫荧光）结合进行共定位研究。
• 局限性：
  • 非凋亡特异的DNA断裂：坏死、强烈机械损伤、固定不当或某些化学处理导致的DNA断裂也会被标记，产生假阳性。
  • 不能区分凋亡阶段：主要检测晚期凋亡（DNA片段化之后）。
  • 操作相对复杂：步骤较多，条件（如蛋白酶K处理）需精细优化。
  • 成本较高：酶和标记dUTP价格较贵。
  • 荧光淬灭：荧光信号随时间减弱。

四、 关键注意事项

1. 避免假阳性：
   • 严格固定：新鲜组织及时、充分固定，避免自溶。
   • 优化蛋白酶K：浓度过高或时间过长导致过度消化，产生非特异性DNA断裂；不足则影响标记效率。需预实验确定最佳条件。
   • 规范操作：避免样本在处理过程中受到物理损伤。
   • 设置严格对照：阴性对照（无TdT酶）和阳性对照（如DNase I处理）至关重要。
2. 避免假阴性：
   • 酶活性保障：TdT酶对反复冻融敏感，分装保存于-20°C或-80°C，反应液新鲜配制。
   • 充分通透：确保反应试剂能到达细胞核DNA。
   • 反应条件优化：TdT浓度、孵育时间、温度需确保足够。
3. 其他：
   • 石蜡切片脱蜡务必彻底。
   • 防止干片：尤其在加样和漂洗间隙。
   • 荧光法需避光操作，防止荧光淬灭。
   • 显色法需严格控制显色时间，避免背景过深或信号不足。
   • 结果判读需谨慎：结合细胞形态学（核固缩、碎裂、凋亡小体）综合判断。

五、 应用领域

TUNEL法在生物医学研究中应用极其广泛：

• 发育生物学：研究胚胎发育过程中组织重塑的细胞凋亡。
• 神经科学：探索神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病、脑卒中）中的神经元凋亡。
• 肿瘤学：评估肿瘤发生、发展、转移及放化疗疗效中的细胞凋亡水平。
• 心血管疾病：研究心肌梗死、心力衰竭、动脉粥样硬化中的心肌细胞凋亡。
• 免疫学：分析免疫细胞（如胸腺细胞阴性选择）的凋亡。
• 药物研发与筛选：评价药物诱导肿瘤细胞凋亡或保护正常细胞免于凋亡的效应。
• 毒理学：评估环境毒素、化学物质对细胞的毒性作用是否涉及凋亡途径。

结论

TUNEL法作为检测细胞凋亡DNA断裂的核心技术，凭借其高特异性和灵敏度，在生命科学和医学研究中占据重要地位。深入理解其原理，严格规范操作流程，合理设置对照并谨慎解读结果，是获得可靠数据的关键。虽然存在假阳性等局限性，但结合形态学观察和其他凋亡检测方法（如Annexin V/PI流式、Caspase活性检测等），TUNEL法仍是揭示生理病理过程中细胞凋亡事件的强大工具。