微血管密度测定：评估血管生成的关键技术
微血管密度（Microvessel Density, MVD）是指单位组织面积内微血管的数量，是定量评估实体组织中血管生成（Angiogenesis）活跃程度的重要形态学指标。血管生成是指从原有血管内皮细胞增殖、迁移而形成新毛细血管的过程，在肿瘤生长、侵袭、转移以及多种非肿瘤性疾病的病理生理过程中扮演着核心角色。MVD测定因此成为基础研究和临床病理诊断中一项至关重要的技术。
一、 测定原理与意义
- 核心原理： 通过对特定血管内皮细胞标志物进行特异性染色（通常利用免疫组织化学技术），在显微镜下识别并计数组织切片中的微血管（主要指毛细血管和小微静脉），计算其在特定视野面积内的数量密度（通常以条/mm²表示）。
- 核心意义：
- 评估血管生成活性： MVD是反映组织内新血管形成程度的直接量化指标，高MVD通常意味着该区域的血管生成异常活跃。
- 预后判断： 在多种恶性肿瘤（如乳腺癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌等）中，大量的研究表明，高MVD往往与不良病理特征（如高分级、淋巴结转移、远处转移潜能增加）和较差的总体生存率、无病生存率显著相关，是具有重要价值的独立预后因子。
- 治疗反应预测与靶点： MVD可帮助预测抗血管生成治疗的潜在敏感性。肿瘤血管生成是抗肿瘤治疗的重要靶点，MVD可作为评估此类药物（如血管内皮生长因子抑制剂）疗效的潜在生物标志物。
- 非肿瘤疾病研究： 在缺血性疾病（如心肌梗塞、脑梗塞后新生血管）、慢性炎症性疾病（如类风湿关节炎）、糖尿病视网膜病变等病理过程中，MVD测定有助于了解疾病进展、修复程度和治疗干预的效果。
二、 主要测定方法
目前最常用、公认度最高的是基于免疫组织化学（IHC）的染色观察计数法。
- 样本准备： 获取新鲜的组织样本（手术切除、活检标本），经中性福尔马林固定，石蜡包埋，切成厚度约为4-5微米的切片。
- 免疫组织化学染色：
- 关键步骤： 选择对血管内皮细胞具有高度特异性的抗体进行染色。
- 常用内皮标记物：
- CD34： 最常用、公认度高的内皮标志物之一，对大多数正常和肿瘤血管内皮着色良好。
- CD31 (PECAM-1)： 敏感性高，特异性强，也是广泛使用的优秀内皮标志物，尤其在淋巴管内皮亦有表达。
- von Willebrand因子 (vWF/Factor VIII-RAg)： 较早使用的标志物，但特异性相对较低（巨核细胞、血小板亦可着色），敏感性有时不如CD34/CD31。
- DAB显色系统： 通常使用棕色DAB（3,3’-二氨基联苯胺）作为显色底物，使得阳性染色的血管呈现清晰可见的棕黄色。
- 微血管的识别与计数：
- 扫描与定位 “热点”(Hot Spot)： 在较低的放大倍数下（如40倍或100倍物镜）系统性地扫描整个组织切片，寻找微血管密度最高的区域。这些“热点”区域通常代表血管生成最旺盛的区域。
- 高倍视野计数： 在选定的“热点”区域，切换到高倍视野（如200倍或400倍物镜）。在显微镜下或利用数字病理图像分析系统，计数视野内所有被抗体染成棕褐色的、明确的内皮细胞或内皮细胞簇所构成的微血管结构。
- 计数规则（关键）：
- 任何被染成棕褐色的、与邻近微血管、肿瘤细胞或结缔组织成分明确分离的内皮细胞或内皮细胞簇，无论有无管腔，均计为一个可计数的微血管。
- 血管腔的存在不是必要条件。
- 具有厚肌层或直径大于8个红细胞（约50μm）的大血管通常不计入MVD。
- 切片破损边缘或组织折叠处的血管应排除。
- 肿瘤细胞巢内部的血管应计入。
- 视野数与重复性： 对于每个“热点”区域，通常需要在多个不重叠的高倍视野下进行计数（例如3-5个视野）。最后计算这些视野内计数的微血管总数除以累计视野面积，得到该“热点”的平均MVD（条/mm²）。通常整个切片需要评估多个（如3个）“热点”，最终报告最高或平均的“热点”MVD值。
- 结果表达： 最终结果表示为平均微血管密度（条/mm²）。
三、 技术要点与质量控制
- 抗体选择与优化： 选择特异性好、灵敏度高的抗体至关重要。染色条件（抗体浓度、孵育时间、抗原修复方法等）需要严格优化和标准化，以确保染色结果的稳定性和可重复性。
- “热点”选择的客观性： “热点”区域的识别是MVD定量的关键步骤，也是主观性相对较高的环节。需要由有经验的病理医师或技术人员进行操作，并最好进行双盲评估或多人评估以增加可靠性。采用系统扫描方法有助于提高客观性。
- 计数标准的一致性： 严格遵守统一的计数规则对于结果的可比性至关重要。不同研究间结果的差异往往源于计数标准的不一致。
- 视野大小与放大倍数： 计数时使用的显微镜视野面积必须精确校准（使用测微尺），计数结果方能准确转换为条/mm²。不同放大倍数下视野面积不同，报告结果时必须注明计数所用物镜倍数（如400倍）。
- 排除非特异性着色： 需仔细辨别特异性内皮着色与非特异性背景着色（如红细胞内的内源性过氧化物酶、组织边缘挤压伤等）。
四、 临床应用领域
- 肿瘤学： 这是MVD应用最广泛的领域。
- 预后评估： 如前所述，高MVD通常提示肿瘤侵袭性强、转移风险增加、预后不良。
- 疗效预测： 评估抗血管生成药物的潜在疗效和耐药性。
- 辅助诊断： 在某些血管源性肿瘤（如血管肉瘤）的诊断中具有价值。
- 研究血管生成机制： 探究肿瘤血管生成的调控因子及其通路。
- 心血管疾病： 评估心肌、脑等缺血组织中的侧枝循环形成和血管新生情况。
- 炎症与风湿免疫疾病： 评估类风湿关节炎滑膜、银屑病皮损等部位血管新生的程度。
- 眼科疾病： 研究糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等疾病中的病理性新生血管。
- 伤口愈合研究： 评估创伤修复过程中肉芽组织的血管形成状态。
五、 局限性与展望
- 技术标准化挑战： 尽管有广泛共识，“热点”选择、计数规则、染色方法等环节仍存在一定的主观性和操作差异，影响不同实验室间结果的直接可比性。亟需更严格、统一的操作规范。
- 反映静态信息： MVD提供的是特定时间点的血管数量信息，无法直接反映血管的功能状态（如灌注、通透性）或动态生成速率。
- “热点”的代表性： 仅计数“热点”区域可能忽略了肿瘤内血管生成的异质性。
- 自动化需求： 人工计数费时费力且存在主观性。基于人工智能和机器学习的数字病理图像分析技术正在快速发展，有望实现更高效、客观、标准化的MVD定量分析，提高结果的准确性、可重复性和可比性，是未来重要的研究方向。
- 多参数整合： 单纯MVD可能不足以全面评估血管生成。结合其他指标（如血管内皮生长因子表达水平、血管形态学参数、灌注功能成像等）进行综合分析，更能全面反映血管生成的状态及其生物学意义。
总结
微血管密度（MVD）测定是评估组织内血管生成活性的基石性定量技术。通过针对血管内皮特异性标志物的免疫组化染色，结合标准化的“热点”选择和计数方法，MVD为肿瘤及其他多种疾病的病理机制研究、预后判断、疗效预测提供了重要的定量依据。尽管存在标准化和自动化方面的挑战，MVD在精准医疗和转化医学研究中仍然发挥着不可替代的关键作用。随着自动化分析技术的进步和多模态评估的应用，MVD这一经典指标的效能和价值在未来有望得到进一步拓展和提升。