炎症因子ELISA

发布时间：2025-07-04 12:02:33 阅读量：1 作者：生物检测中心

炎症因子检测的金标准：酶联免疫吸附试验 (ELISA) 技术详解

前言
炎症是机体应对感染、损伤或刺激的核心防御机制，涉及一系列复杂信号通路。炎症因子（细胞因子、趋化因子等）作为炎症反应的信使，其种类、浓度和动态变化直接反映了炎症的进程、严重程度及性质。精确检测这些因子在基础研究、疾病诊断、预后评估及治疗监测中至关重要。酶联免疫吸附试验 (ELISA) 凭借其高特异性、高灵敏度和操作相对简便的优势，成为炎症因子定量检测的金标准方法之一。

一、 ELISA 技术原理概述
ELISA 的核心原理是利用抗原-抗体特异性结合反应，结合酶促反应的高效放大作用，实现对目标蛋白（此处为特定炎症因子）的精确定量。基本过程包括：

  1. 包被 (Coating)： 将可与目标炎症因子特异性结合的第一抗体（捕获抗体）固定于微孔板孔底表面。
  2. 封闭 (Blocking)： 加入惰性蛋白质溶液（如牛血清白蛋白、脱脂奶粉），封闭微孔板上未被抗体占据的位点，减少后续步骤的非特异性结合，降低背景信号。
  3. 加样与孵育 (Sample & Standard Incubation)： 加入待测样本（血清、血浆、细胞培养上清液、组织匀浆液等）和已知浓度的标准品系列。目标炎症因子与孔底的捕获抗体结合。
  4. 洗涤 (Washing)： 洗去未结合的物质。
  5. 检测抗体孵育 (Detection Antibody Incubation)： 加入能与目标炎症因子另一表位结合的第二抗体（检测抗体），该抗体通常与酶（如辣根过氧化物酶 HRP 或碱性磷酸酶 AP）标记偶联，形成“抗体-抗原-酶标抗体”复合物。
  6. 二次洗涤 (Washing)： 洗去未结合的酶标检测抗体。
  7. 底物显色 (Substrate Addition)： 加入酶的相应显色底物（如 TMB 对应 HRP）。酶催化底物反应，生成有色产物。颜色的深浅与孔中结合的酶标抗体量（即目标炎症因子的初始量）成正比。
  8. 终止反应 (Stop Solution)： 加入终止液（如酸性溶液）终止酶促反应。
  9. 吸光度测定 (Detection)： 使用酶标仪在特定波长（如 TMB 为 450nm，参考波长 540nm或630nm）下测定各孔的吸光度 (OD) 值。
  10. 数据分析 (Data Analysis)： 以标准品浓度（X轴）对其对应的平均 OD 值（Y轴）绘制标准曲线（通常为四参数或双对数曲线）。根据待测样本的 OD 值，在标准曲线上插值计算其浓度。
 

二、 ELISA 在炎症因子检测中的关键环节与注意事项

  1. 样本采集与处理：

    • 样本类型： 最常用血清、血浆。细胞培养上清液、组织匀浆液、脑脊液、尿液等也可检测，但需注意基质效应。
    • 抗凝剂： 如需血浆，推荐使用 EDTA 或 肝素。避免使用柠檬酸钠，因其可能影响某些因子的检测或稳定性。
    • 处理与保存： 血液样本尽快离心分离血清/血浆（推荐 4°C 离心）。炎症因子（尤其某些细胞因子）稳定性差，对反复冻融敏感。建议分装后立即保存于 -70°C 或更低温度，避免反复冻融（≤3次为宜）。检测前样本需充分混匀。

  2. 试剂盒选择与质量控制：

    • 特异性: 确保所用试剂盒能准确识别目标炎症因子，无显著交叉反应。
    • 灵敏度： 满足研究或临床需求的最低检测限 (LOD) 和定量限 (LOQ)。炎症因子浓度范围广（pg/mL 至 ng/mL），需根据预期浓度选择合适灵敏度的试剂盒。
    • 基质效应验证： 对于非血清/血浆样本，需验证试剂盒在该基质下的准确性和回收率。可使用稀释法或标准品加入法评估。
    • 标准曲线与质控品： 每次实验必须包含标准曲线和试剂盒提供的质控品（高、中、低浓度），以监测实验批间差异和试剂性能。标准曲线的拟合度 (R²) 应 > 0.99。
    • 批间差： 尽量使用同一批次试剂盒完成关联样本的检测。若需不同批次，应验证批间一致性。

  3. 实验操作要点：

    • 温度与时间： 严格按照说明书控制孵育温度（通常是室温或 37°C）和时间（避免过长或不足）。
    • 洗涤： 洗涤步骤是降低背景的关键。保证洗涤缓冲液新鲜，洗涤次数和体积充足（通常≥3次，每次加满孔），甩干彻底（避免交叉污染）。
    • 加样精准性： 使用校准好的移液器，避免产生气泡。建议使用多道移液器处理标准品和质控品以提高效率。
    • 显色时间： 严格控制显色反应时间，所有孔应同步终止。显色时间过长可能导致高值样本超出线性范围。
    • 酶标仪设置： 确保仪器校准正确，波长选择无误。

  4. 数据分析与解读：

    • 标准曲线拟合： 选择合适的数学模型（四参数逻辑曲线或双对数曲线最常用）拟合标准曲线。确保拟合良好。
    • 浓度计算： 样本 OD 值应在标准曲线范围内（线性区间最佳）。超出范围需适当稀释后重测。
    • 背景扣除： 通常使用空白孔（仅加缓冲液）或样本稀释液孔的平均 OD 值作为背景值进行扣除。
    • 报告单位： 注意浓度单位（通常是 pg/mL 或 ng/mL）。
    • 参考范围： 解读结果需参考健康人群或特定疾病群体的实验室自身建立的参考范围。不同人群（年龄、性别、种族）、采样时间、样本处理流程等因素均会影响结果。
    • 多因子关联分析： 单一因子意义有限。结合多个相关炎症因子（如促炎因子 IL-6, TNF-α, IL-1β；抗炎因子 IL-10, IL-1RA；趋化因子 IL-8/CXCL8）的水平及其比值（如 IL-6/IL-10）进行分析，更能全面反映炎症状态和免疫平衡。
 

三、 ELISA 检测炎症因子的核心应用价值

  1. 基础医学研究：

    • 解析炎症信号通路机制。
    • 评估实验模型中（动物、细胞）炎症反应的诱导、程度与消退。
    • 研究药物、基因操作等干预措施对炎症的影响。

  2. 临床诊断与疾病监测：

    • 感染性疾病： 区分细菌感染（常伴显著升高的 IL-6, TNF-α）与病毒感染（可能以 IFN-γ, IL-10 变化为主）；脓毒症的辅助诊断与严重程度评估（如 IL-6 是重要指标）。
    • 自身免疫病与风湿病： 类风湿关节炎 (RA) (TNF-α, IL-6, IL-17)、系统性红斑狼疮 (SLE) (IFN-α, IL-6)、强直性脊柱炎 (AS) (TNF-α, IL-17) 等的辅助诊断、活动度评估（如 RA 中 IL-6 与疾病活动度评分 DAS28 相关）及治疗反应监测。
    • 变态反应性疾病： 过敏性疾病中 Th2 型细胞因子（IL-4, IL-5, IL-13）的检测。
    • 心血管疾病： 动脉粥样硬化、心肌梗死中炎症反应的评估（如 CRP 常用，IL-6 是核心调控因子）。
    • 神经炎症相关疾病： 阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化等脑脊液或血液中特定炎症因子的变化。
    • 肿瘤微环境与免疫治疗： 评估肿瘤相关炎症状态及免疫治疗（如免疫检查点抑制剂）引发的免疫反应（如 IFN-γ 升高）。

  3. 预后评估： 某些炎症因子持续高水平或特定谱提示不良预后（如脓毒症中持续高 IL-6）。

  4. 疗效监测： 生物制剂（如抗 TNF-α、抗 IL-6R 抗体）治疗自身免疫病时，监测相应靶点因子或其下游因子的变化，评估疗效。

 

四、 ELISA 方法的优势与局限性

  • 优势：

    • 高特异性： 依赖于高质量的抗原-抗体反应。
    • 高灵敏度： 可检测低至 pg/mL 级别的因子。
    • 高通量： 96孔板或384孔板设计可同时检测大量样本。
    • 重复性好： 标准化操作下结果稳定可靠。
    • 仪器普及： 酶标仪是实验室常规设备。
    • 适用性强： 可检测多种体液和组织样本。
    • 定量准确： 标准曲线法定量结果客观。

  • 局限性：

    • 一次只能检测一个因子： 相比 Luminex 等多因子检测技术通量低。
    • 动态范围有限： 高浓度样本可能需要稀释，增加操作步骤和误差风险。
    • 可能受干扰物质影响： 如样本中的血红蛋白、脂质、类风湿因子、异嗜性抗体等可能导致假阳性或假阴性（封闭剂和样本稀释可部分缓解）。
    • 无法区分活性与非活性形式： 检测的是抗原总量，不区分具有生物活性的与失活/结合状态的因子。
    • 操作步骤较多： 流程相对繁琐，耗时较长（通常需 4-6 小时或过夜孵育）。
    • 对操作者技术要求： 操作的规范性和细节对结果影响较大。
 

五、 总结与展望

ELISA 作为成熟且经过时间检验的技术，在炎症因子的定量检测领域发挥着不可替代的作用。其标准化程度高、结果可靠、成本相对合理的特点，使其成为科研和临床实验室的常规选择。成功应用的关键在于严格把控样本质量、选择合适的试剂系统、规范实验操作流程、严谨进行数据分析和结合临床背景进行解读。

随着技术的进步，基于多重荧光标记或电化学发光原理的高通量多因子检测平台（如 Luminex, MSD）日益普及，能够单次检测数十种炎症因子，在需要大规模筛查或精细描绘炎症网络时具有优势。然而，ELISA 凭借其在单因子检测上可能更高的性价比、更广泛的适用性以及结果的公认度，在未来相当长的时间内，仍将是炎症因子检测领域不可或缺的基石技术。尤其在资源有限或检测目标明确的场景下，ELISA 将继续保持其核心地位。

参考文献：

  1. Lequin, R. M. (2005). Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry, 51(12), 2415-2418.
  2. Crowther, J. R. (2009). The ELISA guidebook (Vol. 149). Springer Science & Business Media. (经典方法学专著)
  3. Dinarello, C. A. (2007). Historical insights into cytokines. European Journal of Immunology, 37(S1), S34-S45. (细胞因子历史与概述)
  4. Pruenster, M., Vogl, T., Roth, J., & Sperandio, M. (2016). S100A8/A9: from basic science to clinical application. Pharmacology & Therapeutics, 167, 120-131. (特定炎症因子研究举例)。
  5. Rittirsch, D., Flierl, M. A., & Ward, P. A. (2008). Harmful molecular mechanisms in sepsis. Nature Reviews Immunology, 8(10), 776-787. (脓毒症中炎症因子的作用)。
  6. McInnes, I. B., & Schett, G. (2011). The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine, 365(23), 2205-2219. (自身免疫病中炎症因子举例)。
 

请注意：实验室建立自己的操作规程时，应依据所选用的特定试剂盒说明书进行操作，并结合本实验室条件进行优化和验证。健康参考范围的建立应基于本实验室对当地健康人群的检测结果。