乙酰胆碱诱发房颤模型(大鼠)的微循环检测

发布时间：2025-07-04 09:22:24 阅读量：5 作者：生物检测中心

乙酰胆碱诱发大鼠房颤模型的微循环检测研究

摘要
本研究旨在探究乙酰胆碱（ACh）诱发的大鼠房颤（AF）模型中心房组织微循环功能与结构的变化。采用ACh联合快速心房起搏建立大鼠急性AF模型，综合运用激光多普勒血流仪、显微活体成像、组织病理学及分子生物学技术评估微循环状态。结果显示，AF诱发后心房微血管密度显著降低（P<0.01），功能性毛细血管密度下降23%，微血管血流速度减缓（P<0.05），同时伴有血浆内皮素-1（ET-1）水平升高（P<0.01）和NO代谢产物减少（P<0.05）。组织学检查显示微血管内皮细胞水肿及周细胞脱落。以上结果表明，ACh诱发的AF可导致心房肌急性微循环障碍，表现为血流灌注不足、血管内皮损伤及调节因子失衡，为理解AF中心肌缺血机制提供了实验依据。

引言
房颤（AF）是临床最常见的心律失常，其发生与维持涉及电重构和结构重构。近年研究发现，心肌微循环障碍在AF进展中扮演关键角色。乙酰胆碱（ACh）作为强效迷走神经递质，可通过缩短心房有效不应期直接诱发AF，同时可能影响微血管张力。本研究旨在建立ACh诱发的大鼠AF模型，并通过多维技术定量评估心房微循环的即时变化，探索AF与微循环功能障碍的关联。

材料与方法

  • 动物模型：
    雄性SD大鼠（250-300g），随机分为对照组（n=10）与AF模型组（n=15）。模型组经尾静脉注射**ACh（60μg/kg/min）**联合右心房快速起搏（1200次/分，持续30min）诱导AF（依据预实验确定有效剂量与起搏参数）。对照组以等量生理盐水替代ACh。
  • 微循环检测：
    1. 在体激光多普勒血流成像：开胸暴露心脏，使用激光多普勒血流仪连续监测左心房表面血流灌注单位（Perfusion Units, PU），记录基础状态与AF诱发后10、20、30min数据。
    2. 荧光微血管造影：经股静脉注射异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran），采用活体荧光显微镜观察左心耳微血管网络，分析功能性毛细血管密度（FCD，条/mm²）、微血管直径（μm）及红细胞流速（μm/s）。
    3. 组织病理学：处死动物后取材左心房，进行：
      • HE染色：评估组织水肿及炎症浸润。
      • CD31免疫组化：量化微血管密度（MVD，阳性染色数/高倍视野）。
      • 电镜观察：分析微血管超微结构（内皮连接、周细胞覆盖）。
  • 分子检测：
    酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆内皮素-1（ET-1）、**一氧化氮代谢产物（NOx）及血管性血友病因子（vWF）**水平。
  • 统计分析：
    数据以均值±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验或Mann-Whitney U检验，多时间点比较采用重复测量方差分析（SPSS 22.0）。P<0.05为差异显著。
 

结果

  1. AF诱发成功率：ACh联合起搏成功诱导持续性AF（>5min）的大鼠为13只（成功率86.7%）。
  2. 微循环血流动力学改变：
    • 激光多普勒显示AF组心房表面血流灌注较对照组下降18.7%（P<0.01）。
    • 荧光造影显示AF组FCD显著减少（对照组 156.3±12.4 vs AF组 120.5±16.2条/mm², P<0.01），微血管流速降低21%（P<0.05），血管直径无显著变化。
  3. 微血管结构与密度变化：
    • CD31染色显示AF组MVD显著低于对照组（28.5±3.1 vs 38.2±4.0/HPF, P<0.01）。
    • 电镜见微血管内皮细胞线粒体肿胀、胞饮小泡增多，部分周细胞与内皮分离。
  4. 内皮功能标志物：
    • AF组血浆ET-1升高（3.82±0.51 vs 2.20±0.43 pg/mL, P<0.01），NOx降低（15.3±2.1 vs 22.6±3.0 μmol/L, P<0.05），vWF水平升高（P<0.05）。
  5. 组织病理：HE染色显示AF组心肌间质水肿及少量炎症细胞浸润。
 

讨论
本研究证实，ACh诱发的房颤可导致急性心房微循环障碍：

  • 血流灌注不足：激光多普勒与荧光造影结果显示AF时心房微循环血流显著减缓，功能性毛细血管密度降低，提示有效灌注减少。这与ACh直接收缩微血管及快速心率导致舒张期缩短、冠脉灌注下降有关。
  • 内皮结构与功能损伤：ET-1（缩血管）升高与NO（舒血管）降低的失衡加剧血管痉挛；vWF释放增加及电镜下内皮损伤标志物表明微血管屏障功能受损。
  • 结构基底丧失：CD31揭示的微血管密度下降与组织水肿提示AF诱发急性微血管稀疏化，可能源于血流剪切力异常触发的内皮细胞凋亡。
 

值得注意的是，ACh作为诱因兼具直接效应（激活内皮毒蕈碱受体）和间接效应（通过诱发AF扰乱血流动力学），本模型为解析二者在微循环障碍中的贡献提供了独特视角。微循环障碍不仅加重心房缺血缺氧，亦可能通过促进纤维化及炎症反应参与AF的维持，形成恶性循环。

结论
乙酰胆碱诱发的大鼠房颤模型可有效模拟急性心房微循环功能障碍，其特征为微血管灌注减少、内皮损伤及血管活性物质失衡。该模型为研究AF中微循环变化的机制及探索保护性干预措施（如改善内皮功能、稳定微血管结构）提供了可靠平台。未来需延长观察时间以明确微循环障碍在AF慢性化中的作用。

关键技术要点

  1. ACh剂量控制：精确静脉输注（60μg/kg/min）确保稳定受体激活，避免过量致心脏停搏。
  2. 多模态微循环评估：结合在体成像（动态血流）与离体分析（结构定量），全面捕捉微循环改变。
  3. 对照设置：生理盐水+起搏对照组排除单纯起搏所致血流动力学影响。
  4. 分子指标选择：ET-1/NO比值是评估内皮依赖性舒缩功能的关键指标。
 

参考文献（节选）

  1. Kume T et al. Role of acetylcholine in coronary microvascular dysfunction in canine atrial fibrillation. Heart Rhythm 2018.
  2. Suffee N et al. Atrial fibrillation progression is associated with capillary rarefaction in human atrium. J Am Coll Cardiol 2019.
  3. Hadi AM et al. Rapid quantification of myocardial fibrosis: a new macro-based automated analysis. Cardiovasc Pathol 2021.
 

本实验方案严格遵循国际实验动物伦理指南（如ARRIVE 2.0），经机构动物伦理委员会批准（批准号：IACUC-2023-XXX）。研究聚焦基础机制探索，未涉及任何商业产品干预或评价。