乙酰胆碱诱发房颤模型(大鼠)的线粒体功能检测

乙酰胆碱诱发大鼠房颤模型的线粒体功能检测研究

摘要：
本研究旨在探讨乙酰胆碱诱发大鼠心房颤动（房颤）模型中，心房心肌细胞线粒体功能的变化特征。通过开胸手术对大鼠心包膜注射乙酰胆碱建立急性房颤模型，分离心房组织线粒体，综合评估呼吸链活性、膜电位、活性氧生成、ATP合成及形态学变化。结果表明，乙酰胆碱诱发的房颤与心肌线粒体功能障碍显著相关，表现为氧化磷酸化受损、膜电位去极化及氧化应激增强。本研究为房颤能量代谢紊乱机制提供了重要的实验依据。

关键词： 乙酰胆碱；心房颤动；线粒体功能；氧化应激；大鼠模型；能量代谢

1. 引言

心房颤动（房颤）是临床最常见的心律失常，其发生发展与心肌能量代谢异常密切相关。线粒体作为细胞能量工厂，其功能障碍可导致ATP合成不足、活性氧（ROS）爆发，促进心房电重构与结构重构。乙酰胆碱（ACh）通过激活毒蕈碱型胆碱受体，缩短心房有效不应期，是常用的房颤诱导剂。本研究拟建立ACh诱发的大鼠房颤模型，系统评估心房线粒体功能状态，为阐明房颤中线粒体损伤的病理机制提供实验基础。

2. 材料与方法

2.1 实验动物分组

雄性SD大鼠（体重250-300g）随机分组（n=8/组）：

对照组（Sham）： 开胸后心包注射等量生理盐水
房颤模型组（AF）： 开胸后心包注射乙酰胆碱（50 μmol/L, 0.2 mL）诱发房颤

所有操作遵循动物伦理委员会指南，术后予镇痛处理。

2.2 房颤模型建立与确认

麻醉与开胸： 戊巴比妥钠腹腔麻醉（40 mg/kg），气管插管机械通气，左侧开胸暴露心脏。
乙酰胆碱诱发房颤： 心包膜单次注射乙酰胆碱溶液（50 μmol/L），持续记录心电图（ECG），房颤（P波消失、RR间期绝对不规则）持续＞30秒视为建模成功。

2.3 心房组织线粒体分离

快速取心房组织，预冷PBS冲洗。
差速离心法提取线粒体：组织匀浆 → 700g离心10min → 上清液10000g离心10min → 沉淀重悬于线粒体保存液（MSM：甘露醇220mM，蔗糖70mM，HEPES 5mM，pH 7.4）。
Bradford法测定蛋白浓度，调整为10 μg/μL备用。

2.4 线粒体功能检测

呼吸链复合物活性（分光光度法）
- 复合物 I（NADH脱氢酶）： 检测340nm NADH氧化速率
- 复合物 III（泛醌-细胞色素c还原酶）： 检测550nm Cyt c还原速率
- 复合物 IV（细胞色素c氧化酶）： 检测550nm Cyt c氧化速率
线粒体膜电位（JC-1荧光探针）
- JC-1（2 μM）孵育30min，荧光显微镜/流式细胞仪检测红绿荧光比值（590/530 nm），比值下降提示去极化。
ATP合成速率
- 生物发光法（ATP检测试剂盒），单位：nmol/min/mg蛋白。
活性氧（ROS）生成
- DCFH-DA（10 μM）负载30min，荧光分光光度计检测530nm激发/590nm发射荧光强度。
电镜观察线粒体超微结构
- 心房组织经戊二醛固定、锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切片铅铀染色，透射电镜观察线粒体形态与嵴结构。