牙膏口腔厌氧菌生物膜清除率刃天青显色检测法

发布时间：2025-07-04 08:24:38 阅读量：1 作者：生物检测中心

牙膏口腔厌氧菌生物膜清除率刃天青显色检测法

摘要： 口腔生物膜（牙菌斑）是口腔疾病的主要诱因，其中厌氧菌扮演关键角色。准确评估牙膏清除口腔厌氧菌生物膜的能力对判断其清洁功效至关重要。本文阐述了一种基于刃天青（Resazurin）氧化还原显色原理的体外检测方法，用于定量评价牙膏对口腔厌氧菌生物膜的清除率。该方法具有操作简便、灵敏度高、结果直观可视等优点。

一、引言
口腔生物膜是由多种微生物及其胞外基质在牙面或其他口腔硬组织表面形成的复杂三维结构群落。厌氧菌，如变异链球菌（Streptococcus mutans）、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）、牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）等，在生物膜深层缺氧环境下大量定植，是龋病、牙周病等口腔感染性疾病的主要病原微生物。有效清除或抑制这些厌氧菌生物膜的生长是评价牙膏口腔清洁效果的核心指标之一。

传统的生物膜定量方法（如菌落形成单位计数法、结晶紫染色法）存在耗时长、步骤繁琐或无法区分活/死菌等局限性。刃天青显色法利用刃天青作为氧化还原指示剂，活细胞代谢过程中产生的还原酶可将其不可逆地还原为粉红色的试卤灵（Resorufin），其颜色变化强度与活细胞数量及代谢活性成正比，为快速、灵敏地评估生物膜内活菌数量提供了一种有效手段。

二、材料与方法

  1. 主要试剂与材料：

    • 刃天青（Resazurin Sodium Salt，分析纯）
    • 脑心浸液肉汤（BHI）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）或其他适宜厌氧菌生长的培养基
    • 磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.2-7.4）
    • 无菌生理盐水
    • 特定牙膏样品（需经预处理，制备成均匀悬液供试液）
    • 阳性对照（如0.2%葡萄糖酸氯己定溶液）
    • 阴性对照（无菌PBS或培养基）
    • 96孔平底细胞培养板
    • 厌氧培养系统（厌氧罐/箱及产气袋）
    • 酶标仪（具备560nm激发光/590nm发射光检测功能）
    • 恒温培养箱
    • 无菌操作设备（超净工作台、离心机、微量移液器等）

  2. 实验菌株：

    • 标准口腔厌氧菌株，如变异链球菌（ATCC 25175）、具核梭杆菌（ATCC 25586）等。可选择单一菌种或建立代表性混合菌种模型进行测试。
    • 菌株需定期复苏、传代，保证活力。

  3. 厌氧菌生物膜培养：

    1. 将活化好的目标厌氧菌接种于适宜的厌氧液体培养基中，在厌氧条件下（85% N₂, 10% H₂, 5% CO₂），37°C培养至对数生长期中期（通常18-24小时）。
    2. 调整菌液浓度至约1×10^6 - 1×10^7 CFU/mL（麦氏比浊法）。
    3. 向96孔板每孔加入200μL调整好的菌悬液（或混合菌悬液）。设立空白孔（仅加培养基）。
    4. 将96孔板置于厌氧罐/箱中，37°C厌氧培养24-48小时（具体时间依据菌株生物膜形成能力和模型要求确定），形成成熟的厌氧菌生物膜。
    5. 培养结束后，小心吸弃孔内上清液及浮游菌。
    6. 用无菌PBS轻柔漂洗生物膜2-3次，去除未粘附的细菌和非特异性杂质。每次漂洗后需小心吸干残留液体。

  4. 样品处理与作用：

    1. 牙膏样品预处理： 精确称取定量牙膏，加入适量无菌生理盐水（或特定溶剂），剧烈涡旋或振荡，制备成均匀的牙膏悬液（如1%， w/v）。可根据实验设计制备不同浓度的供试液。
    2. 向已形成生物膜的孔内加入200μL待测供试液（不同浓度的牙膏悬液、阳性对照液、阴性对照液）。空白孔（生物膜孔）加入200μL无菌PBS或培养基。每个样品/浓度设置3-6个复孔。
    3. 将96孔板置于37°C厌氧条件下孵育处理一定时间（如1小时、2小时、5分钟等，根据产品宣称作用时间或研究目的设定）。
    4. 孵育结束后，小心吸弃孔内液体。
    5. 用无菌PBS轻柔漂洗生物膜2-3次，彻底去除残留的样品成分。每次漂洗后需小心吸干残留液体。

  5. 刃天青显色与检测：

    1. 制备刃天青工作液：用无菌PBS或无菌生理盐水溶解刃天青粉末，配制成一定浓度（通常为0.01-0.1 mg/mL，常用10 μg/mL）的工作液。避光保存。
    2. 向每个处理后的生物膜孔（包括空白对照孔）加入100μL无菌PBS或培养基（确保生物膜保持湿润）。
    3. 每孔加入20μL刃天青工作液（终浓度通常为0.001-0.02 mg/mL）。混匀。
    4. 将96孔板置于37°C厌氧条件下避光孵育（孵育时间需预实验确定，通常30分钟至2小时，如60分钟），使活性细胞代谢还原刃天青。
    5. 孵育结束后，轻轻晃动混匀孔内液体（或用移液器吹打数次）。
    6. 使用酶标仪，设定激发波长（Ex）为560 nm，发射波长（Em）为590 nm，读取每孔的荧光强度（Relative Fluorescence Units, RFU）。若使用可见光比色法，则在570 nm或600 nm处测定吸光度（OD值）。

  6. 生物膜活性清除率计算：

    1. 计算各组（不同浓度牙膏、阳性对照、阴性对照）的平均荧光强度（RFU）或平均吸光度（OD值）（RFU/OD_sample）。
    2. 计算阴性对照组（例如PBS处理组）的平均RFU/OD值（RFU/OD_NC），代表未经清除处理的生物膜活性（通常设定为100%活性）。
    3. 计算阳性对照组（如氯己定溶液）的平均RFU/OD值（RFU/OD_PC），代表接近完全清除的生物膜活性（接近0%活性）。
    4. 计算空白孔（仅有培养基+刃天青，无生物膜）的平均RFU/OD值（RFU/OD_Blank），作为背景值。
    5. 样品对生物膜活性的清除率（% Inhibition）计算公式如下：
      清除率 (%) = [1 - (RFU/OD_sample - RFU/OD_Blank) / (RFU/OD_NC - RFU/OD_Blank)] × 100%
      • 更严谨的计算可引入阳性对照作为参考：
        清除率 (%) = [(RFU/OD_NC - RFU/OD_sample) / (RFU/OD_NC - RFU/OD_PC)] × 100% (此公式认为阳性对照清除率为100%)
    6. 统计分析不同处理组清除率的显著性差异（如t检验、ANOVA）。
 

三、结果判读

  • 刃天青被还原的程度直接反映生物膜中活菌的代谢活性。
  • 颜色肉眼观察： 未还原的刃天青呈蓝色，完全还原为试卤灵后呈粉红色或紫色。颜色越粉红/紫，表明孔内存活的活性细菌越多，清除效果越差；颜色越接近蓝色（或无明显变色），表明活性细菌越少，清除效果越好。
  • 荧光/吸光度定量： RFU值或OD值越高，表明还原产生的试卤灵越多，生物膜活性越高，清除效果越差；反之，RFU值或OD值越低（接近空白背景值），表明生物膜活性被有效抑制或清除，清除效果越好。
 

四、方法优势与局限性

  • 优势：
    • 快速高效： 相比传统CFU计数法（通常需培养48小时以上），检测周期大大缩短（显色反应仅需30-120分钟）。
    • 灵敏度高： 对活细胞的代谢活力响应灵敏。
    • 无损检测： 检测过程无需破坏生物膜结构，可进行动态监测（同一孔不同时间点检测）。
    • 高通量： 适用于96孔板或更高通量的微孔板，便于同时测试多个样品或浓度。
    • 结果直观： 颜色变化肉眼可见，定性判断简便；仪器定量客观准确。
    • 低成本： 试剂成本相对较低。
  • 局限性：
    • 反映代谢活性而非绝对菌量： 检测的是细胞还原酶的活性，严格意义上反映的是生物膜的总代谢活力（活细胞数量和代谢水平的综合体现），并非直接等同于活菌数量（CFU）。强杀菌剂可能快速杀死细菌但初期还原酶活性仍存在。
    • 生物膜结构影响： 试剂渗透性可能受生物膜厚度和胞外基质影响。
    • 需优化条件： 刃天青浓度、显色孵育时间、菌种特性等需要优化，否则可能影响准确性和重复性。
    • 需配套验证： 对于关键评价或机制研究，建议结合CFU计数法或显微镜观察法（如荧光死活染色）进行验证和互补。
 

五、讨论与应用
刃天青显色法为体外评价牙膏清除口腔厌氧菌生物膜的功效提供了一种可靠的工具。通过标准化操作流程（菌株选择、培养条件、生物膜成熟度、样品浓度、作用时间、显色参数等），该方法可有效比较不同配方牙膏对目标厌氧菌生物膜的清除能力差异，筛选有效成分，优化配方设计，并为产品功效宣称提供科学依据。

该方法同样适用于评估漱口水、口腔喷雾、牙粉等其他口腔护理用品，以及对生物膜有抑制作用的抗菌剂、天然提取物等的功效研究。其高通量特性尤其适合进行大规模筛选。

六、结论
刃天青显色检测法是一种基于微生物代谢活性的、快速、灵敏、高通量的体外检测技术。将其应用于牙膏对口腔厌氧菌生物膜清除率的评价，能够客观、定量地反映产品抑制或杀灭生物膜内活性厌氧菌的能力，是口腔护理产品研发和质量控制中评估清洁与抗菌功效的重要方法之一。实际应用中，应充分认识到其反映代谢活性的本质，并在必要时结合其他方法进行综合评估。